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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 30, N° 1  - janvier 2007
pp. 76-97
Doi : JFO-01-2007-30-1-0181-5512-101019-200609700
REVUE GÉNÉRALE
Méthodes d’évaluation de la surface oculaire dans les syndromes secs
 

A. Labbé [1 et 2], F. Brignole-Baudouin [2 et 3], C. Baudouin [1 et 2]
[1] Service d’ophtalmologie 3, Centre Hospitalier National d’Ophtalmologie des Quinze-Vingts, Paris.
[2] INSERM U 598, Institut Biomédical des Cordeliers, Universités Paris-5 et Versailles.
[3] Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie, Université Paris-5, Paris.

Tirés à part : C. Baudouin,

[4] Service d’Ophtalmologie 3, CHNO des Quinze-Vingts, 28, rue de Charenton, 75012 Paris. baudouin@quinze-vingts.fr

Résumé
Méthodes d’évaluation de la surface oculaire dans les syndromes secs

Le syndrome d’œil sec est une entité clinico-pathologique complexe impliquant le film lacrymal, les glandes lacrymales, les paupières, ainsi qu’un grand nombre des cellules de la surface oculaire incluant les cellules épithéliales, les cellules inflammatoires et immunitaires, et les cellules à mucus. Des méthodes d’investigation variées ont été développées pour évaluer le film lacrymal tant sur le plan structurel que fonctionnel : mesure du ménisque des larmes, fluorophotométrie, meibométrie, interférométrie, taux d’évaporation, osmolarité des larmes, ou encore thermographie. Le syndrome d’œil sec se traduit également au niveau de la surface oculaire par des irrégularités cornéennes, qui peuvent être explorées par les techniques de vidéokératographie ou de microscopie confocale in vivo, et des perturbations optiques confirmées par aberrométrie. Les empreintes conjonctivales restent une méthode classique pour apprécier les altérations cellulaires de la surface oculaire. Cette technique a largement bénéficié des progrès en matière de microscopie confocale, de biologie moléculaire, et de cytométrie en flux. L’étude biologique des protéines des larmes ou d’autres médiateurs est aussi très utile, mais présente des limites importantes liées au recueil des larmes, et ce, particulièrement chez les patients avec un syndrome sec, et au manque de standardisation de la majorité des mesures. L’osmolarité des larmes, l’électrophorèse et le dosage des protéines normales des larmes comme le lysozyme ou la lactoferrine, restent les tests les plus utiles. Enfin, des explorations extra-oculaires comme le dosage des anticorps antinucléaires ou une biopsie des glandes salivaires accessoires peuvent être nécessaires pour confirmer le diagnostic de syndrome de Sjögren.

Abstract
Ocular surface investigations in dry eye
A. Labbé, F. Brignole-Baudouin, C. Baudouin

Dry eye is a complex clinicopathological entity involving tear film, lacrimal glands, eyelids, and a wide spectrum of ocular surface cells, including epithelial, inflammatory, immune, and goblet cells. From the tightly regulated lacrimal film functions and structure, a large variety of investigations have been developed, including tear meniscus measurements, fluorophotometry, meibometry, interference pattern analysis, evaporation rate, tear osmolarity, and thermography. Dry eye conditions also interfere with the ocular surface, causing corneal irregularities that may be explored using the techniques of videokeratography and in vivo confocal microscopy, or optical impairment, as confirmed by aberrometry. At the level of ocular surface cells, impression cytology remains a standard for assessing cell alterations. It has greatly benefited from new confocal microscopy, molecular biology, and flow cytometry techniques. Biological assessment of tear proteins or other mediators is also useful. Major limits should be acknowledged, however, such as technical issues in tear film collection, especially in dry eyes, and the lack of standardization of most measurements. Tear osmolarity, electrophoresis, and dosage of normal tear proteins, such as lysozyme or lactoferrin, remain the most useful tests. Finally, some extraocular explorations such as accessory gland biopsy or serum antinuclear antibody dosage may be useful for assessing the diagnosis of Sjögren’s syndrome.

Mots clés : Surface oculaire , syndromes secs , film lacrymal , syndrome de Sjögren , méthodes d’évaluation

Keywords: Ocular surface , dry eye , tear film , Sjögren’s syndrome , tests


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INTRODUCTION
LE FILM LACRYMAL  (+)
ÉVALUATION CLINIQUE DE LA SURFACE OCULAIRE ET DU FILM LACRYMAL  (+)
LES EMPREINTES CONJONCTIVALES  (+)
ANALYSE BIOLOGIQUE DU FILM LACRYMAL : TESTS STANDARDS ET DE ROUTINE  (+)
ANALYSE BIOLOGIQUE DU FILM LACRYMAL : TESTS DE RECHERCHE  (+)
LES TESTS DIAGNOSTIQUES : CONTRIBUTION AU DIAGNOSTIC ÉTIOLOGIQUE  (+)
CONCLUSION
Références
INTRODUCTION

Le syndrome d’œil sec, par déficit de sécrétion aqueuse ou par évaporation, est une maladie de la surface oculaire multifactorielle qui implique principalement le film lacrymal et les épithéliums oculaires superficiels. Les interactions entre ces deux structures sont extrêmement complexes et l’exploration du syndrome sec doit s’intéresser aux épithéliums cornéen et conjonctival, au film lacrymal dans son ensemble incluant la couche pré-oculaire, les glandes lacrymales, les glandes de Meibomius, ainsi qu’aux paupières. Un grand nombre de tests ont été développés pour mieux comprendre la physiologie du film lacrymal, analyser les composants des larmes et les cellules de la surface oculaire, dans les conditions normales et pathologiques. Après un bref rappel de la composition du film lacrymal et de sa structure, cette revue décrit les méthodes d’exploration de la surface oculaire les plus pertinentes dans les syndromes secs et les maladies de la surface oculaire liées à cette pathologie complexe.
LE FILM LACRYMAL
Composition

Le film lacrymal est la deuxième ligne de défense de la surface oculaire après les paupières. Le volume du film lacrymal est de 7 à 9 µL, avec une sécrétion basale de 1 à 2 µL/min [1]. La mesure exacte de l’épaisseur du film lacrymal reste cependant un sujet de controverse, entre 7 et 40 µm selon les auteurs [2], [3]. Jusqu’à très récemment, le film lacrymal était considéré comme composé de trois couches distinctes (muqueuse, aqueuse et lipidique), mais en fait le film lacrymal ressemble plus à un gel avec un gradient de concentration de mucus depuis la couche superficielle de l’épithélium, où il adhère fortement par l’intermédiaire du glycocalix, à la couche externe, moins concentrée en mucines solubles et recouverte par la couche lipidique qui limite l’évaporation des larmes. Les larmes sont éliminées en partie par évaporation mais surtout par les conduits lacrymo-nasaux.

L’épaisseur de la couche muqueuse est source de discussion. En fonction des auteurs, de la technique utilisée, ou du fait qu’elle soit intégrée ou non à la couche aqueuse, les mesures varient entre 2 et 40 µm [3], [4], [5]. Les mucines sont des glycoprotéines de haut poids moléculaire (2 000 à 40 000 kDa) et sont glycosylées de manière très importante [6]. Les mucines solubles et les mucines formant des gels sont sécrétées par les cellules à mucus de la conjonctive. Les mucines jouent un rôle majeur en rendant la surface oculaire hydrophile à l’inverse de son état naturel hydrophobe. De plus, les mucines diminuent la tension de surface des larmes. Au-dessus d’une concentration de 1 %, les larmes forment un gel de haute viscosité au comportement non newtonien. D’autres mucines fixées aux membranes cellulaires participent à la couche muqueuse du film lacrymal adhérente à la surface épithéliale. L’adhérence du film lacrymal à la surface oculaire est aussi augmentée par les microvillosités et les invaginations des membranes de l’épithélium recouvertes du glycocalix qui participent à la stabilité du film lacrymal en rendant la surface oculaire hydrophile. De plus le glycocalix interagit avec les mucines formant des gels et les mucines solubles, particulièrement MUC5AC qui est sécrétée par les cellules à mucus, et d’autres mucines solubles comme MUC2 ou MUC7 qui est sécrétée par la glande lacrymale. Dix-neuf gènes ont été identifiés depuis MUC1 jusqu’à MUC17 (avec deux formes pour MUC3 et MUC5), huit de ces gènes étant connus pour être associés à la surface oculaire ou les glandes lacrymales. Les mucines membranaires MUC1, MUC4, et MUC16 ont été retrouvées dans les épithéliums cornéen et conjonctival [6]. Des mucines membranaires peuvent être également retrouvées sous forme soluble dans le film lacrymal. En plus de leur rôle dans la mouillabilité des cellules de surface ainsi qu’un rôle probable de barrière face aux pathogènes, les mucines membranaires, et spécialement MUC4, ont un domaine Epidermal-Growth — Factor like (EGF-like) qui pourrait directement influencer la croissance et la régulation épithéliale [7]. La mucine soluble MUC7 a également un domaine histatin-like qui pourrait avoir des propriétés anti-fongiques [8].

La couche aqueuse est la couche la plus épaisse du film lacrymal. Elle est composée majoritairement d’eau (98 %) et de mucines, mais elle contient également des électrolytes, des facteurs de croissance (parmi eux EGF joue un rôle critique dans la physiologie de l’épithélium cornéen et la cicatrisation), des cytokines, des immunoglobulines, et des cellules inflammatoires et desquamées. La sécrétion basale est assurée par les glandes accessoires de Krause et Wolfring, alors que la sécrétion réflexe et la plupart des protéines sont produites par la glande lacrymale principale. Cette notion a été remise en question par ceux qui pensent que la sécrétion aqueuse a un contrôle nerveux et que la glande lacrymale principale et les glandes accessoires ont des fonctions similaires. Ces protéines jouent un rôle primordial dans la défense de la surface oculaire contre des agents microbiens par la sécrétion de lysozyme, bêta-lysine, lactoferrine, IgA, IgG, et de protéines sériques filtrées à travers les acini des glandes lacrymales [1]. Les protéines des larmes jouent également un rôle important dans la viscosité des larmes. Les lipocalines, qui sont des protéines associées aux lipides et sécrétées par les glandes lacrymales, associées à la lactoferrine et aux IgA sécrétoires, forment à leur concentration physiologique dans les larmes un gel de haute viscosité non newtonien [9]. La tension de surface faible des larmes serait liée à certaines protéines et possiblement à certains lipides complexés avec des lipocalines des larmes au moins autant qu’aux mucines solubles seules [4], [5]. Il a aussi été démontré que des lipides d’origine non meibomienne étaient présents en grandes concentrations dans la couche aqueuse du film lacrymal et que leur suppression augmentait la tension de surface des larmes [10]. Une tension de surface élevée, comme dans le cas de l’œil sec, entraîne une instabilité du film lacrymal et représente un facteur d’agression important des cellules de la surface oculaire.

La couche lipidique est produite en grande partie par les glandes de Meibomius, des glandes de type holocrine situées au niveau du tarse. Son épaisseur varie entre 1 et 100 nm, mais la plupart des études l’estiment entre 90 et 100 nm [4]. En utilisant la technique de meibométrie, il a été calculé que la quantité totale des sécrétions meibomiennes peut atteindre 300 µg dans le réservoir marginal normal et 9 µg dans le film lacrymal pré-oculaire [11], [12]. Les huiles meibomiennes sont libérées lors du clignement et réparties sur le film lacrymal entre chaque clignement. L’épaisseur et la stabilité du film lacrymal dépendent de la capacité d’expression des glandes de Meibomius. Le meibum est une mixture complexe faite de protéines [13] et surtout de différents composés lipidiques qui varient de manière importante d’un sujet à l’autre [4]. Il est composé majoritairement d’esters de cires (15 à 35 %), d’esters de stérols (8 à 34 %), de triglycérides (4 à 43 %), d’acides gras libres (2 à 24 %), de lipides polarisés (0 à 16 %) et d’hydrocarbones d’origine probablement environnementale. Un grand nombre de ces esters de cholestérol seraient un substrat favorable pour les micro-organismes commensaux qui constitueraient un élément important dans le développement d’un dysfonctionnement des glandes de Meibomius (DGM) [14]. Deux couches distinctes, les lipides polarisés et les lipides non polarisés composés majoritairement de phospholipides, forment la partie externe du film lacrymal et jouent un rôle clé en limitant l’évaporation entre deux clignements. Le modèle proposé par Holly [4] suggère que les lipides non polarisés soient étalés sur une surface de lipides polarisés. La couche lipidique interagirait également avec les lipides liés aux lipocalines dans la phase aqueuse. Les lipocalines sécrétées par les glandes lacrymales participeraient également à la stabilité du film lacrymal en prévenant la pénétration de lipides d’origine cutanée qui rompent la stabilité du film lacrymal [5], [9], [15], mais cette hypothèse est controversée [16].
Les rôles principaux du film lacrymal

Chaque couche du film lacrymal joue un rôle important dans la physiologie de la surface oculaire. La couche aqueuse hydrate la cornée, prévient de la kératinisation et donc de l’opacification, et véhicule des protéines protectrices. La couche muqueuse permet au film lacrymal de se répartir sur la surface des cellules épithéliales et participe à l’élimination des corps étrangers et des microorganismes. Au-delà de la fonction de barrière des trois couches du film lacrymal, l’accès des microorganismes à la surface oculaire est prévenu par des propriétés antibactérienne et antifongiques de certaines mucines (particulièrement MUC7), des protéines des larmes, et même des lipides meibomiens [4].

Les deux couches muqueuse et lipidique participent à la stabilité du film lacrymal. Les mucines jouent un rôle dans l’adhérence du film lacrymal aux cellules épithéliales, et la couche lipidique superficielle limite l’évaporation des larmes. La suppression complète des lipides du film lacrymal ou l’obstruction des glandes de Meibomius augmenterait considérablement le taux d’évaporation et l’osmolarité des larmes [4]. N’importe quelle anomalie de l’un des composants des larmes entraînerait ainsi une instabilité du film lacrymal et une hyperosmolarité. En plus de son action contre le dessèchement et la pénétration de microorganismes, le film lacrymal participe aussi au pouvoir réfractif de la cornée en lissant la surface épithéliale et en facilitant le processus de cicatrisation et la pénétration de l’oxygène dans la cornée. Le film lacrymal contient des enzymes anti-oxydantes qui pourraient protéger les cellules de la surface oculaire contre le stress oxydant. Chaque composant défectueux peut affecter de manière très importante la stabilité et l’homéostasie du film lacrymal. Même si les causes de l’œil sec sont multifactorielles, elles peuvent être reliées à une déficience de n’importe lequel des éléments de la surface oculaire ou du film lacrymal.
ÉVALUATION CLINIQUE DE LA SURFACE OCULAIRE ET DU FILM LACRYMAL

Malgré leur utilisation fréquente en pratique clinique, les tests standards pour évaluer le syndrome sec et les maladies de la surface oculaire — recherche des symptômes, temps de rupture du film lacrymal, testing des glandes de Meibomius, test à la fluorescéine cornéen, test de Schirmer — ont montré une reproductibilité et une fiabilité faibles [17]. De plus, les symptômes subjectifs ne sont que très rarement corrélés aux signes objectifs. De nombreuses autres techniques d’exploration ont donc été développées pour évaluer objectivement le film lacrymal et la surface oculaire en pratique clinique d’une manière peu ou pas invasive. Certaines sont facilement accessibles aux cliniciens, alors que d’autres restent des procédures de recherche qui nécessitent encore d’être validées mais pourraient constituer dans un futur proche une batterie de méthodes fiables pour l’évaluation clinique des désordres de la surface oculaire.
Évaluation du volume et de la sécrétion des larmes
Hauteur du ménisque des larmes

La plus grande partie du film lacrymal se situe au niveau du ménisque lacrymal. Des tentatives ont été réalisées pour mesurer la hauteur du ménisque des larmes comme marqueur du volume du film lacrymal qui est diminué de manière importante dans les syndromes secs par déficience aqueuse. À la différence du test de Schirmer 1 qui mesure aussi une partie de la sécrétion réflexe, la hauteur du ménisque des larmes représente le volume basal des larmes. Des photographies du ménisque des larmes peuvent être utilisées pour mesurer sa hauteur, son rayon ou sa largeur, mais ces mesures nécessitent une instillation de fluorescéine [18] ou un appareil de réflexion spéculaire. Un vidéoméniscomètre qui projette des bandes blanches et noires, et enregistre en temps réel le comportement du ménisque dans le temps a été développé [19], [20]. Le rayon du ménisque peut ainsi être calculé à partir d’images séquentielles. Au centre de la marge de la paupière inférieure, le rayon du ménisque a été trouvé significativement diminué dans l’œil sec (0,17 ± 0,05 mm) comparé aux sujets normaux (0,30 ± 0,1 mm) et très augmenté après occlusion du point lacrymal (0,57 ± 0,23 mm). Une valeur seuil de 0,25 mm a été proposée par les auteurs, avec une sensibilité et une spécificité de 88,9 % et 77,8 % respectivement (voir revue, dans Yokoi and Komuro [20]). Plus récemment encore, l’OCT® de segment antérieur a aussi été utilisé avec succès pour évaluer le ménisque lacrymal (fig. 1) [21]. De manière intéressante, ces techniques ont aussi été utilisées pour évaluer l’élimination de collyres instillés dans les culs-de-sac conjonctivaux. Le temps de rétention de différents substituts lacrymaux peut ainsi être facilement comparé en utilisant cette procédure qui apportera certainement dans le futur de nombreuses applications pharmacologiques.
Fluorophotométrie des larmes

La fluorophotométrie des larmes a été développée initialement par David Maurice en 1963. La technique a été améliorée par l’utilisation de fluorophotomètres automatisés de grande sensibilité (Fluorotron Master®, Coherent Radiation, Inc., États-Unis) [22], [23]. Le volume des larmes et leur renouvellement peuvent être calculés après l’application d’une goutte de fluorescéine et le recueil d’un échantillon de larmes. Eter et Gobbels ont récemment proposé une technique non contact de fluorophotométrie des larmes en établissant une calibration avec différentes concentrations de fluorescéine dans une chambre test [24]. Cela a rendu possible la mesure du volume des larmes et son renouvellement sans recueil d’un échantillon de larmes. La disparition de la fluorescéine après instillation de 1 µL de fluorescéine à 2 % est enregistrée sur une période de plus de 30 minutes. Cette élimination suivrait une courbe biphasique permettant de calculer un taux de renouvellement du film lacrymal [25]. Dans la plupart des études de la littérature [25], le flux normal de larmes approche 1 µL/minute, avec un temps de renouvellement des larmes de 15 à 22 %/minute. Ce flux diminue dans l’œil sec à des valeurs entre 0,10 et 0,55 µL/minute et entre 6 à 8 %/minute respectivement, avec des taux plus élevés dans les atteintes meibomiennes par rapport aux déficits aqueux. À cause de la concentration de fluorescéine utilisée, du temps choisi pour effectuer les mesures séquentielles après instillation, de l’influence du temps d’examen, et du manque de standardisation de cette technique, les résultats peuvent être très différents d’un investigateur à l’autre, raison pour laquelle cette technique n’est pas devenue pour l’instant un standard dans l’exploration des syndromes secs.
Techniques d’évaluation de la couche lipidique
Meibographie et meibométrie

Les sécrétions des glandes de Meibomius sont des composants intrinsèques du film lacrymal et jouent un rôle majeur dans la stabilisation du film lacrymal entre chaque clignement. Les dysfonctionnements des glandes de Meibomius (DGM) sont une cause fréquente d’instabilité du film lacrymal et un des mécanismes principaux du syndrome sec par évaporation. Les techniques de meibographie ont été développées pour étudier la morphologie des glandes de Meibomius et leur contenu [26]. Un test par transillumination est utilisé dans ce but et peut identifier une perte partielle ou totale des structures visibles des glandes de Meibomius (tableau I). La destruction des glandes de Meibomius est la marque des dysfonctionnements meibomiens, mais la meibographie peut être utile dans d’autres maladies de la surface oculaire pour analyser l’aspect des glandes de Meibomius. Il a été montré qu’une destruction significative des glandes de Meibomius survenait dans à peu près 58 % des yeux avec un syndrome de Sjögren [27].

La meibométrie permet de quantifier le volume de la couche lipidique. Différentes techniques ont été décrites pour analyser la concentration, évaluer le taux de sécrétion, et collecter les lipides au niveau de la marge palpébrale. Un prélèvement lipidique est obtenu en utilisant une lamelle de plastique de 8 ou 20 mm de large appliqué pendant 3 à 10 secondes dans le tiers central de la marge palpébrale inférieure, l’œil regardant vers le haut. La lamelle est séchée à l’air ambiant, et la densité optique est mesurée avec un meibomètre [20], [28]. Des améliorations ont été proposées pour le recueil des lipides et leur analyse [28]. Une technique utilisant un laser a récemment été proposée par Komuro et al. [29]. Cette technique semble bien corrélée à la quantité de lipides contenus dans les sécrétions meibomiennes et le degré d’expression des glandes, le volume de la couche lipidique obtenu par meibométrie étant augmenté dans les syndromes secs par déficit aqueux et diminué dans le cas d’un dysfonctionnement meibomien [28], [29]. Les calculs faits chez des sujets sains avec un meibomètre ont montré que les sécrétions meibomiennes sur la marge palpébrale atteignaient approximativement 300 µg et constituaient un large réservoir pour la couche lipidique préoculaire du film lacrymal qui aurait un volume de 9 µL [12].
Interférométrie

L’aspect des interférences générées par réflexion spéculaire d’une lumière froide (pour limiter l’évaporation induite par la chaleur) sur la couche lipidique du film lacrymal préoculaire, fournit des informations intéressantes concernant l’épaisseur de la couche lipidique, sa répartition et sa stabilité. Différents appareils ont été développés (Tearscope Plus®, Keeler Instruments, Broomall, États-Unis ; DR-1®, Kowa Co., Ltd., Torrance, États-Unis) pour analyser l’aspect des interférences [30], [31], [32], [33]. Plusieurs classifications ont été proposées. Yokoi et al. [34] ont proposé cinq stades : au stade 1, la couche lipidique a un aspect grisâtre et une distribution uniforme ; au stade 2, de couleur grisâtre, elle présente une distribution non uniforme ; au stade 3, la répartition est non uniforme avec des interférences colorées ; au stade 4, on observe de nombreuses couleurs avec une distribution non uniforme ; et au stade 5, il existe des zones de cornée exposées avec absence de couche lipidique. Les films lacrymaux normaux sont cotés entre 1 et 2, les yeux secs sont cotés entre 2 et 5, le grade 2 pouvant être retrouvé dans des films lacrymaux normaux comme dans les yeux secs [20]. La classification proposée par Guillon et al. [30], [35] en utilisant le Tearscope Plus® est un peu différente. Elle est subdivisée en 10 niveaux différents (tableau II). Les niveaux les plus élevés ont été retrouvés de manière prédominante chez les nouveau-nés et les enfants, montrant une couche lipidique épaisse, alors que les adultes se distribuaient à des niveaux inférieurs [35]. Une limite majeure de cette technique reste néanmoins la très grande variabilité des aspects normaux ; 37 %, 33 %, et 15 % des yeux normaux d’adultes ont été côtés entre les niveaux 2 et 7, indiquant que les aspects anormaux étaient uniquement situés aux extrêmes de cette classification, que sont l’absence de lipides ou une épaisseur augmentée avec un aspect globulaire (fig. 2).

Une amélioration de l’analyse des interférences a été proposée en utilisant des enregistrements vidéo de la répartition du film lacrymal et de ses aspects [36], [37] ou en offrant des graphiques assistés par ordinateur coloré en fonction de l’épaisseur de la couche lipidique [38]. Des études dynamiques de la couche lipidique du film lacrymal après le clignement montrent chez le sujet normal, une stabilisation complète en moins d’une seconde après une propagation d’aspect horizontal. Dans des cas de dysfonctionnements meibomiens ou dans les cas de déficits aqueux, le temps pour atteindre un film lacrymal stable est beaucoup plus long, de plusieurs secondes ou plus, et l’aspect de la propagation est vertical et inégal, avec une couche lipidique plus épaisse en cornée inférieure et plus mince, déficiente, en cornée supérieure [38].

Toutes ces techniques sont utiles pour étudier de manière non invasive le film lacrymal préoculaire et particulièrement sa composante lipidique, son épaisseur à l’aide de mesures qualitatives et semi-quantitatives, sa dynamique juste après le clignement, et sa stabilité dans le temps. Cependant, le potentiel discriminatif de ces tests est limité par le chevauchement entre les aspects normaux et ceux retrouvés dans des yeux secs modérés. Cela limite l’utilisation de ces méthodes basées sur les interférences comme techniques de référence pour l’analyse du syndrome sec en pratique clinique.
Mesure des taux d’évaporation

L’évaporation du film lacrymal semble être le résultat de la stabilité et de la composition de la couche lipidique et possiblement de l’épithélium cornéen, mais elle dépend également de nombreux facteurs individuels et environnementaux, comme la surface interpalpébrale, la position des yeux, le degré d’hygrométrie, les conditions lumineuses et la température. Il existe aussi de grandes variations entre les différentes espèces et en fonction de l’âge. Les jeunes enfants clignent nettement moins que les adultes, en grande partie à cause de meilleures propriétés anti-évaporatives du film lacrymal [39]. Le temps de rupture du film lacrymal et l’épaisseur de la couche lipidique mesurés par la une technique biomicroscopique d’interférométrie ont été trouvés plus longs et plus épais chez les enfants de 3 à 6 mois par rapport aux adultes [35]. Différents appareils et procédures ont été décrits, mais le principe fondamental est de mesurer l’humidité dans le temps avec un évaporimètre dans une chambre isolée réalisée par des lunettes adhérentes à l’intérieur desquelles la quantité d’eau et la température sont connues. La plupart des chercheurs ont tenté de standardiser ces mesures et spécialement l’évaporation de la peau [40] ou en soustrayant l’évaporation calculée paupières fermées [39], [41]. Le taux d’évaporation varie dans la littérature entre 4 et 15 × 10–7 g.cm–2.s–1 pour des yeux normaux [39]. Des résultats contradictoires ont été observés en comparant les taux d’évaporation normaux et ceux retrouvés dans les syndromes secs, avec des valeurs s’étalant entre 7 et 59 g.cm–2.s–1 [25]. La plupart de ces études montrent néanmoins une augmentation du taux d’évaporation dans les syndromes secs [42], avec une hyperosmolarité et une température plus élevée, diminuée après le clignement [43]. Les dysfonctionnements meibomiens entraînent systématiquement une augmentation très importante de l’évaporation par rapport aux yeux normaux ou aux syndromes secs par insuffisance lacrymale. Cependant, les valeurs observées d’une étude à l’autre ne sont pas constantes et montrent de grandes variations des taux d’évaporation calculés. Néanmoins, le taux d’évaporation est bien corrélé avec la destruction des glandes de Meibomius, les patients associant un syndrome sec par déficience aqueuse et un dysfonctionnement meibomien ont le taux d’évaporation le plus élevé [44]. Il apparaît d’après ces études que la proportion du volume lacrymal perdu par évaporation atteint 10 à 15 %, même si des taux allant jusqu’à 30 % ont été calculés par d’autres groupes. Ces taux augmentent jusqu’à 50 % et parfois 70 % du total de la sécrétion de larmes dans les yeux secs, indépendamment de leurs mécanismes [25].

La thermographie utilise une méthode indirecte pour évaluer le taux d’évaporation. La température de la cornée est plus élevée juste après le clignement et diminue rapidement après l’ouverture des yeux. Ces changements subtils peuvent être enregistrés par une nouvelle génération de thermographes très rapides utilisant les radiations infrarouges, qui peuvent mesurer plus de 60 valeurs par seconde et calculer un coefficient de diminution de température. En utilisant cette technique, il a été démontré que les patients avec un syndrome sec présentaient des variations de température après le clignement plus faibles que les patients normaux [45]. La thermographie peut devenir une technique intéressante pour mieux évaluer les anomalies du film lacrymal.

Une relation entre la température et l’inflammation de la surface oculaire a aussi été suggérée. Une augmentation de la température aurait été retrouvée dans les yeux secs grâce à la technique de thermographie aux infrarouges [46]. Les conditions d’examen doivent cependant être standardisées pour toutes ces évaluations fonctionnelles du film lacrymal (température constante de la pièce, humidité, luminance, position fixe des yeux), ce qui rend leur diffusion difficile pour la plupart des cliniciens.
Analyse optique de la surface oculaire
Vidéokératographie

Un des rôles majeurs du film lacrymal est de lisser la surface cornéenne et d’offrir une interface air/cornée la plus régulière possible. Il a été démontré qu’une irrégularité dans le film lacrymal résultant soit de points de sécheresse lacrymale, soit d’une augmentation de l’épaisseur du film lacrymal, ou d’une surface irrégulière du film lacrymal entre deux clignements, pourrait affecter de manière importante les qualités optiques de l’œil et entraîner une vision brouillée dans l’œil sec [47]. La technique de vidéokératographie a montré que les indices les plus importants de la surface oculaire, l’index de régularité de surface (SRI) et l’index d’asymétrie de surface (SAI), sont très atteints dans les syndromes secs. Des logiciels spécifiques qui analysent ces indices chaque seconde pendant 10 secondes augmentent considérablement la sensibilité de l’analyse de la stabilité du film lacrymal [48]. Cette technique nécessite cependant une anesthésie topique de manière à ce que les patients puissent garder l’œil ouvert pendant 10 secondes, mais cette instillation ne semble pas influencer la stabilité du film lacrymal [49]. Un autre ajustement similaire des mesures obtenues en vidéokératographie, utilisant un enregistrement successif du SRI et du SAI quatre fois par seconde pendant 15 secondes, offre également un moyen pour suivre dans le temps la formation et la rupture du film lacrymal après le clignement [50]. L’étalement optimal du film lacrymal prend quelques secondes et les indices diminuent dans la plupart des cas, mais pas systématiquement, quand progressivement ils approchent du temps de rupture du film lacrymal. Parce que la vidéokératographie est une technique accessible à un grand nombre de cliniciens et disponible dans la plupart des centres ophtalmologiques, cette procédure peut devenir une technique simple et non invasive pour une évaluation cinétique du film lacrymal.
Analyse des fronts d’onde

Le récent développement des analyses de front d’onde utilisant des aberromètres de type Hartmann-Shack a aussi fourni une meilleure compréhension des anomalies optiques résultant d’une déficience du film lacrymal. La rupture du film lacrymal a été reconnue comme entraînant des aberrations de haut degré [51], [52]. Dans l’œil sec aussi on retrouve une augmentation des aberrations totales et des aberrations de haut degré, spécialement les comas et les aberrations de type sphérique, en vision photopique et scotopique, par rapport aux sujets normaux [53]. Cette technique rend possible une analyse plus fine et une quantification de l’atteinte optique dont se plaignent la plupart des patients aux yeux secs, même en l’absence de kératite superficielle, sachant que les instabilités du film lacrymal entraîneraient aussi des aberrations optiques.
Les changements morphologiques des cellules de la surface oculaire

Les techniques de microscopie confocale in vivo de nouvelle génération (Confoscan®, Nidek, or Corneal Module/HRT-II®, Heidelberg Engineering) peuvent maintenant explorer la cornée, le limbe et la conjonctive à un niveau de résolution cellulaire. Les épithéliums superficiels sont facilement différentiés (fig. 3), et les infiltrats de cellules inflammatoires ou les cellules à mucus peuvent aussi être étudiés par cette technique totalement indolore et quasiment non invasive, même si elle requiert un contact entre l’objectif et la surface oculaire. La kératoconjonctivite sèche (KCS) montre des changements importants au niveau de la morphologie de l’épithélium cornéen, avec un élargissement des cellules épithéliales et une augmentation de la réflectivité des noyaux, qui prennent un aspect de type conjonctival, associé à des infiltrations modérées et parfois sévères de cellules dendritiques inflammatoires au niveau conjonctival et en périphérie de la cornée. Dans ces cas, les cellules à mucus disparaissent complètement. Dans d’autres cas, un dysfonctionnement des cellules souches limbiques peut être reconnu par l’invasion de cellules épithéliales conjonctivales et de cellules à mucus dans la cornée. Une corrélation spectaculaire entre les images de microscopie confocale in vivo et les caractéristiques histopathologiques provenant d’empreintes cornéennes et conjonctivales a été démontrée [54]. Ces instruments vont devenir dans un futur proche des éléments majeurs pour l’analyse de la surface oculaire de manière quasi non-invasive.
LES EMPREINTES CONJONCTIVALES
Analyse cytologique
Principes généraux

Développée à la fin des années 1970 [55], [56], l’empreinte conjonctivale est maintenant une technique bien connue et facilement reproductible, permettant le recueil des cellules épithéliales conjonctivales d’une manière non- ou très peu invasive, rapide et quasiment indolore, pour une analyse biologique des maladies de la surface oculaire. Grâce aux empreintes conjonctivales, les cellules les plus superficielles de l’épithélium conjonctival, c’est-à-dire les cellules qui desquament, sont recueillies (fig. 4). L’épithélium conjonctival se renouvelle par l’intermédiaire des couches basales profondes, et les couches les plus superficielles qui ont atteint leur stade de différenciation définitif sont progressivement évacuées dans les fluides lacrymaux. Les empreintes conjonctivales permettent le recueil des cellules localisées dans les couches superficielles de la conjonctive.

À ce niveau, trois types de populations cellulaires conjonctivales peuvent être retrouvés sur des empreintes conjonctivales, les cellules épithéliales, les cellules à mucus, et les cellules inflammatoires. Jusqu’à maintenant, les cellules épithéliales n’étaient considérées que comme la limite externe de la muqueuse conjonctivale, mais il a été très largement démontré qu’elles sont directement impliquées dans de nombreuses réactions biologiques, particulièrement dans les processus inflammatoires et apoptotiques [57], [58], [59]. Les cellules à mucus libèrent des mucines solubles dans le film lacrymal et de cette manière jouent un rôle de régulation et de défense important au niveau de la surface oculaire. La perte de cellules à mucus est la marque des syndromes secs [60], alors que la présence de cellules à mucus sur des empreintes obtenues à partir de la surface cornéenne est pathognomonique de la conjonctivalisation associée aux déficits en cellules souches limbiques [61]. Les cellules inflammatoires incluent les cellules dendritiques, connues pour leur forme caractéristique et leur propriété d’immunocompétence, les cellules de Langerhans et aussi des populations de lymphocytes localisées dans l’épithélium ou migrant depuis le chorion sous-épithélial.

Les empreintes conjonctivales classiques permettent de calculer la densité des cellules à mucus et de coter la métaplasie squameuse, particulièrement dans l’œil sec. L’identification de cellules épithéliales contenant une chromatine en forme de serpent ou « snake-likechromatin » (fig. 5) ou des inclusions intra-épithéliales, des cellules non épithéliales provenant des couches profondes de la conjonctive (lymphocytes, cellules dendritiques, éosinophiles) (fig. 6) et mêmes d’autres microorganismes, est possible. L’analyse de ces différentes populations cellulaires — leur taille, nombre, densité, et modifications pathologiques — apporte des informations importantes concernant le statut de la surface oculaire. Les empreintes conjonctivales sont beaucoup plus accessibles et sont obtenues de manière moins agressive que les prélèvements cornéens et apportent indirectement des informations sur l’atteinte cornéo-conjonctivale, notamment dans le domaine de l’œil sec, des pathologies limbiques, et de l’inflammation chronique de la surface oculaire. Cette technique pourrait également avoir un intérêt dans la détection des infestations de microorganismes au niveau de la surface oculaire [62], [63], [64].
Aspects techniques [59], [65]

La méthode consiste en la récupération de la couche la plus superficielle des cellules conjonctivales, qui ont atteint leur stade terminal de différenciation et vont être éliminées. Pour cela, des filtres communément utilisés en biochimie comme l’acétate de cellulose, la nitrocellulose, le Biopore® (Millipore Billerica) ou des filtres de polyethersulfone (Supor®, Gelman Sciences) sont appliqués sur la conjonctive. Ils mesurent en général 13 mm de diamètre et présentent des pores de diamètre compris entre 0,025 à 0,45 µm. Les filtres les plus utilisés ont des pores qui mesurent 0,20 µm de diamètre. Les cellules conjonctivales qui vont desquamer adhèrent facilement à la surface de la membrane, formant une couche homogène et fine de cellules. Avec ou sans une anesthésie topique (une goutte d’oxybuprocaïne), un ou plusieurs filtres sont délicatement appliqués sur la conjonctive bulbaire supérieure. Les membranes sont retirées immédiatement ou après un contact de quelques secondes. Les parties supérieures et supéro-temporales de la conjonctive bulbaire protégées par la paupière supérieure doivent être différenciées de celles prélevées dans les zones interpalpébrales. La conjonctive palpébrale inférieure peut aussi être explorée, ce qui a été proposé par Nelson et Wright [66] pour différencier les maladies extrinsèques comme la kératoconjonctivite sèche (KCS) intéressant seulement les zones interpalpébrales, des maladies de la surface oculaire intrinsèques comme les conjonctivites fibrosantes qui intéressent les deux conjonctives. Néanmoins, pour des recherches ou des évaluations régulières, les cellules conjonctivales doivent toujours être collectées dans la même zone, qui doit être notée pour les explorations suivantes.

De nombreuses techniques de coloration peuvent être utilisées pour la microscopie classique. Elles doivent cependant être compatibles avec le procédé technique qui va rendre la membrane transparente. L’acide périodique de Schiff et le bleu alcian sont très utilisés pour identifier les cellules à mucus ; l’hématoxilyne, la coloration de Gill modifiée par Papanicolaou et le May-Grünwald-Giemsa colorent les cellules épithéliales [67]. L’utilisation de la microscopie électronique à transmission et à balayage a également été décrite, apportant une meilleure compréhension des changements ultrastructuraux de la surface oculaire et l’identification de particules virales [65].
Classifications actuelles

Plusieurs systèmes de classification ont été développés [65]. Nelson, le premier en 1983 et en 1988, a proposé une classification en quatre stades de la métaplasie squameuse basée sur la morphologie des cellules épithéliales et la densité en cellules à mucus et leur forme (tableau III). La taille des cellules et leur coloration, le rapport nucléocytoplasmique, et les changements chromatiniens sont les critères classiques des différentes classifications habituellement utilisées. Celles proposées par Tseng en 1985 [67] et par Adams et al. en 1998 [68] ont aussi comme but de quantifier la métaplasie squameuse en cotant la transition d’un épithélium normal non kératinisé riche en cellules à mucus jusqu’à un épithélium totalement kératinisé non sécrétant. La densité en cellules immunitaires est aussi un indicateur pour les maladies inflammatoires conjonctivales.
Applications clinico-pathologiques des empreintes conjonctivales classiques

La quasi-totalité des yeux normaux ont des empreintes conjonctivales cotées grade 0 ou 1 selon la classification de Nelson, mais de très grandes variations peuvent être observées, en fonction de la localisation sur la cornée, du sexe, du cycle ovulatoire, de la prise de contraceptif, et même de l’heure du recueil des cellules [65]. L’âge peut aussi influencer les résultats des empreintes conjonctivales : le rapport nucléo-cytoplasmique diminue avec l’âge et des aspects de « snake-like chromatin » ont été retrouvés chez 39 % des sujets âgés [69]. Le comptage des cellules à mucus semble ne pas être influencé par l’âge, mais la répétition d’empreintes dans la même zone conjonctivale [70] et le port de lentilles de contact [71] augmentent la densité en cellules à mucus, suggérant que la stimulation des cellules à mucus intervient comme une réponse adaptative précoce à des microtraumatismes ou à des réactions inflammatoires (fig. 7). De plus, la migration des cellules à mucus sur la surface cornéenne est un signe de conjonctivalisation et démontre un déficit en cellules souches limbiques ou tout au moins leur dysfonctionnement [72]. Même si les empreintes cornéennes sont plus agressives et souvent plus difficiles à obtenir que les empreintes conjonctivales, cette technique, associée ou non à un immunomarquage des cytokératines, offre une méthode intéressante pour évaluer les lésions cornéennes avec atteinte limbique.

Cependant, la plupart des études sur les désordres chroniques de la surface oculaire, comme les syndromes secs, les conjonctivites chroniques, la rosacée oculaire, l’utilisation au long cours de collyres anti-glaucomateux, ou le port prolongé de lentilles de contact, aboutissent toujours à une baisse importante et parfois une disparition des cellules à mucus [60], [73]. La perte des cellules à mucus et la métaplasie squameuse sont des signes non spécifiques de la KCS. En plus de l’atteinte des cellules à mucus, les cellules épithéliales subissent des transformations importantes, comme un allongement cellulaire, un gonflement, une augmentation de la surface cytoplasmique entraînant une diminution du rapport nucléo-cytoplasmique de 1:1 à 1:8, une pycnose nucléaire, ou l’apparition de « snake-like chromatin » [65], [74].
Les techniques d’immunocytologie

L’exploitation de la technique classique de cytologie conjonctivale reste cependant limitée. Pour cette raison, de nouvelles procédures — par exemple, les techniques immunocytologiques — ont été développées durant ces dix dernières années. Au départ, la technique d’immunofluorescence ne pouvait pas être pratiquée directement sur les empreintes permettant le recueil des cellules. Ces cellules conjonctivales devaient être transférées sur un support transparent, entraînant un risque de perte ou d’altération cellulaires [65], [75]. L’utilisation d’un microscope confocal a rendu possible les techniques d’immunofluorescence directement sur ces empreintes (fig. 8 et 9) [65], [73]. Les techniques d’immunoperoxydase peuvent aussi être utilisées sur les empreintes avant de les rendre transparentes pour un examen microscopique [76]. Dans les deux cas, de nombreux marqueurs peuvent être utilisés pour identifier les cellules ou leur activation, et analyser les épithéliums de surface à la recherche de réactions inflammatoires. Cependant, ces techniques d’immunocytologie ne permettent pas de quantifier de manière fiable les marqueurs d’activation. Ces analyses morphologiques peuvent donc être avantageusement complétées par des techniques de quantification en particulier par la cytométrie en flux.
L’analyse des empreintes conjonctivales en cytométrie en flux
Les principes techniques de la cytométrie en flux

La cytométrie en flux a offert à la biologie cellulaire de nombreuses avancées depuis les années 1970. Malgré le développement de techniques encore plus sophistiquées de biologie moléculaire, les applications de la cytométrie en flux s’accroissent. La technique consiste en l’illumination individuelle de cellules en suspension avec un faisceau laser de haute énergie et monochromatique. Les cellules ainsi illuminées réfléchissent le signal lumineux sur un angle étroit (autour de 10 degrés) proportionnel à leur taille (dispersion en avant) et les autres signaux lumineux sur un angle large (autour de 90 degrés) proportionnel à leur structure ou à leur densité intracellulaire (dispersion latérale). Des signaux colorés sont aussi émis, correspondant à l’autofluorescence ou à la fluorescence transmise quand les cellules ont été marquées avec un marqueur fluorescent comme les anticorps conjugués à la fluorescéine. La détection de très faibles concentrations de cellules, aussi faibles que 100 à 500 cellules/mL, ainsi que d’intensité faible de fluorescence, est possible. Au-delà de la caractérisation des cellules, la cytométrie en flux permet également l’exploration de leur fonction et une approche physiologique.

L’exploration des cellules de la surface oculaire rencontre plusieurs difficultés : les cellules adhérentes aux membranes forment un tissu pauci-cellulaire qui contient des sous populations de cellules rares. Pour le recueil d’échantillons de cellules, des biopsies conjonctivales ainsi que des cytologies par brossage ont été proposées [77]. Ces techniques collectent un grand nombre de cellules et permettent l’analyse des cellules profondes, mais parce qu’elles sont plus invasives, elles ne sont pas facilement proposées en routine. Les empreintes conjonctivales, offrent une méthode alternative non invasive et moins douloureuse, pour recueillir les cellules superficielles de la conjonctive. L’utilisation de la cytométrie en flux pour l’analyse des empreintes conjonctivales [78] a été développée pour obtenir une technique précise et reproductible permettant d’explorer les désordres de la surface oculaire et analyser l’efficacité ou la toxicité de certaines drogues. Trois pathologies principales ont directement bénéficié de cette nouvelle technique : l’allergie, les syndromes secs, et les atteintes toxiques [73], [79], [80], [81].

Les filtres habituels en polyethersulfone collectent facilement le nombre de cellules conjonctivales nécessaire pour l’analyse en cytométrie en flux [59]. Les cellules doivent être prélevées au moins 15 minutes après l’instillation de la dernière goutte de colorant (fluorescéine, rose bengale ou vert de lissamine) pour éviter toute interférence avec les analyses en immunofluorescence. Après avoir retiré la membrane, elles sont immédiatement transférées dans des tubes contenant une solution tampon comme le PBS, ou un produit fixant comme le paraformaldehyde à 0,05 %. Les tubes doivent être conservés à une température de 4 C avant et après le recueil des cellules pour éviter les réactions apoptotiques et la dégradation des échantillons durant la phase de fixation. Dans ces conditions, les empreintes avec les cellules conjonctivales peuvent être stockées plusieurs jours et envoyées au laboratoire dans des récipients réfrigérés, avant d’être préparées pour l’analyse en cytométrie en flux. L’extraction des cellules peut être effectuée manuellement par une agitation douce à l’aide d’une pipette. Le nombre de cellules collectées varie entre 2.105 et 106 par empreintes. Après centrifugation dans une solution saline, les cellules conjonctivales sont ensuite immunomarquées et analysées en cytométrie en flux.
Les marqueurs principaux pour l’exploration des pathologies de la surface oculaire

Les maladies de la surface oculaire sont associées à différents types d’altérations cellulaires : une perte de cellules à mucus, des réactions métaplasiques induisant une exfoliation cellulaire progressive et une desquamation, une augmentation en parallèle du nombre de cellules inflammatoires notamment les cellules dendritiques, et à l’activation des cellules épithéliales sur un mode inflammatoire [78], [82]. Les techniques de détection de l’apoptose cellulaire induite par des processus toxiques ou inflammatoires et actuellement accessibles à la technique de cytométrie en flux comprennent : la diminution de la taille des cellules, l’expression de marqueurs cellulaires comme l’annexine-V et l’Apo 2.7, et la détermination du pic sub-G1 du cycle cellulaire [79]. De plus, les phénomènes immuno-inflammatoires peuvent être reconnus grâce à des marqueurs caractéristiques comme l’expression des antigènes de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité HLA-DR, grâce à l’amplification de molécules d’adhésions, ou à la présence de molécules appartenant à la famille des récepteurs au TNF-α (CD40, Fas) ou des interleukines [59], [82]. Une étude récente a montré que cette technique doit permettre de discriminer les marqueurs des systèmes TH1 et TH2, par la présence des récepteurs aux chimiokines CCR5 et CCR4 respectivement, qui sont exprimés de manière très importante au niveau des cellules épithéliales dans le syndrome de Sjögren pour le CCR5 et dans la conjonctivite vernale pour CCR4 [83]. Une augmentation de l’expression de CCR5 a également été retrouvée dans les syndromes secs associés aux maladies de la surface oculaire [84]. Il semblerait que de tous ces marqueurs, l’expression de HLA-DR, normalement limitée aux cellules immunitaires mais surexprimée par les cellules épithéliales dans le cas d’une inflammation induite par le système immunitaire, soit le facteur le plus pertinent. De par sa très grande sensibilité, dépendante de l’intensité des réactions inflammatoires, HLA-DR est actuellement un des meilleurs marqueurs d’inflammation au niveau de la surface oculaire.
Applications clinicopathologiques

La cytométrie en flux a été très utilisée pour explorer les désordres de la surface oculaire et a permis de reconnaître les réactions inflammatoires comme un composant majeur de maladies cliniquement non inflammatoires comme l’œil sec, ou les réactions iatrogènes entraînées par les collyres et particulièrement les conservateurs [81], [85]. Le syndrome de Sjögren est une maladie auto-immune qui atteint non seulement la glande lacrymale mais aussi la surface oculaire dans son ensemble. Une inflammation chronique associée à une infiltration de lymphocytes et une apoptose des cellules épithéliales conjonctivales sont observées dans l’œil sec [86]. D’autres syndromes secs d’étiologies différentes — hormonaux, environnementaux, ou iatrogènes — sont aussi caractérisés par des processus inflammatoires [67]. Les cellules épithéliales conjonctivales expriment HLA-DR lors d’une activation cellulaire d’origine immunitaire et dans des conditions inflammatoires. L’expression de HLA-DR est proportionnelle au niveau d’inflammation conjonctivale, avec des niveaux particulièrement élevés chez les patients avec un syndrome de Sjögren [79]. La cytométrie en flux a donc été utilisée dans des études multicentriques dont le but était de déterminer les niveaux d’inflammation chez des patients souffrant de KCS, et évaluer les effets de la cyclosporine A en collyre. HLA-DR a été retrouvé à des niveaux très élevés avant traitement, et diminué de manière très importante sous traitement lors d’un suivi de 6 mois, alors que le véhicule, agissant comme une larme artificielle, n’influençait pas significativement l’expression de HLA-DR [87].

Les conséquences toxiques ou immunologiques de l’utilisation au long cours de traitements topiques, y compris certains traitements de l’œil sec, sont une autre cause majeure d’altération de la surface oculaire. Les composants des collyres, le composant actif ou le conservateur, peuvent provoquer des irritations ou des allergies après une utilisation prolongée. Cette toxicité induit rapidement une métaplasie des cellules conjonctivales avec une perte des microvillosités, une nécrose, une libération d’enzyme, une production de cytokines pro-inflammatoires ou de dérivés de l’acide arachidonique, et l’infiltration de la conjonctive par des cellules inflammatoires et des fibroblastes [85], [88], [89]. Le conservateur le plus utilisé est le chlorure de benzalkonium à une concentration variant entre 0,005 % et 0,02 %. Les études ex vivo sur des empreintes conjonctivales ont confirmé l’expression significativement plus élevée de HLA-DR et ICAM-1, associée à une diminution significative de la densité en cellules à mucus, chez les yeux recevant pour le traitement d’un glaucome des bêta-bloquants conservés au long cours, par rapport aux yeux traités avec des collyres non conservés [81].

La technique des empreintes conjonctivales est donc d’un grand intérêt pour détecter les réactions inflammatoires et toxiques induites par les collyres au niveau de la surface oculaire et peut être proposée dans le futur comme instrument pour juger de l’innocuité de traitements oculaires dans des études pré-cliniques et cliniques.
Autres applications des empreintes conjonctivales en biologie moléculaire

La technique de reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) a été utilisée sur des empreintes conjonctivales dès 1994 [90] et a permis d’identifier des cytokines inflammatoires dans des membranes provenant des yeux de patients avec un syndrome de Sjögren. Jones et al. [90] et Pflugfelder et al. [91] ont observé une importante expression d’ARNm codant pour l’interleukine (IL)-6 et l’IL-8, HLA-DR, ICAM-1, TNF-α, IL-1 α, IL-1 β et le transforming growth factor-β 1 (TGF-β 1) dans l’épithélium conjonctival des yeux présentant un syndrome de Sjögren par rapport aux yeux normaux, en utilisant la technique de RT-PCR sur des empreintes conjonctivales.

En recherche, d’autres applications ont été décrites dans les domaines des mucines oculaires, de la détection de particules virales, des greffes de cellules souches, des lentilles de contact, et des gènes d’enzymes anti-oxydantes [65], [92]. La technique de PCR en temps réel, a aussi été utilisée pour déterminer les gènes des mucines de la conjonctive normale. Une grande quantité de gènes peuvent être exprimés dans l’œil normal : MUC1, MUC2, MUC4, le gène des mucines formant des gels MUC5AC, MUC7, MUC13, et MUC15-17 [93]. MUC5AC est le gène le plus important associé aux cellules à mucus. De manière directe par RT-PCR ou en utilisant des techniques d’immunomarquages pour identifier ses produits muciniques, le gène MUC5AC peut être utilisé pour identifier et compter le nombre de cellules à mucus (fig. 8a).
ANALYSE BIOLOGIQUE DU FILM LACRYMAL : TESTS STANDARDS ET DE ROUTINE
Considération générale sur les méthodes biologiques et les échantillons de larmes

Durant ces dernières années, de nombreuses techniques biologiques ont été développées pour analyser les valeurs normales de différents paramètres biologiques du film lacrymal. Certaines d’entre elles demandent des procédures complexes dans des laboratoires spécialisés et nécessitent encore d’être validées. Nous présentons ici celles qui sont validées scientifiquement et totalement accessibles à n’importe quel laboratoire équipé avec un matériel standard. La plupart de ces techniques ont pour but de déterminer des états pathologiques, spécialement ceux concernant l’œil sec et les atteintes de la glande lacrymale. Leur intérêt principal repose dans le fait qu’elles peuvent discriminer les syndromes secs par déficit aqueux lié à une atteinte de la glande lacrymale, de l’instabilité du film lacrymal dans lequel les protéines lacrymales ne sont théoriquement pas atteintes. Le principal inconvénient de ces techniques est la très grande réduction de volume du film lacrymal dans les syndromes secs par déficit aqueux, l’utilisation de techniques de stimulation des larmes, mécaniques ou chimiques, risquant de causer un biais en stimulant la sécrétion réflexe et l’arrivée de protéines, spécialement d’albumine, résultant d’une fuite de sérum. Ce point a une importance cruciale sur la mesure des protéines totales ou sur celle de la fibronectine comme marqueur des protéines du sérum, qui peuvent augmenter 20 fois après induction d’un larmoiement réflexe et au moins 200 fois quand les larmes sont collectées immédiatement après le réveil. Ce dernier résultat pourrait être lié à une inflammation infraclinique pendant la nuit et la fermeture des yeux prolongées [94].

Dans certains cas, la réalisation d’un échantillon de larmes d’un volume aussi petit que 15 µL peut prendre plus de 40 minutes sans stimulation réflexe [95]. Dans le syndrome de Sjögren, il n’est pas rare de ne pas obtenir de larmes, malgré des tentatives prolongées et des stimulations répétées. Cet obstacle est donc une limitation majeure à toutes les analyses biologiques du film lacrymal et de nombreux chercheurs ont essayé de développer des techniques nécessitant de très faibles quantités de larmes, de l’ordre de quelques microlitres. Cependant certaines techniques biologiques nécessitent un volume minimal. Différentes méthodes pour dépasser ce problème de recueil de larmes ont été essayées, par exemple en diluant dans de l’eau distillée les larmes recueillies avec une micropipette avant de reconcentrer les protéines pour les dosages, ou en recueillant les larmes à partir des papiers de test de Schirmer ou de membranes-filtres en papier [80].

Même si elle est simple et pratique, cette technique peut altérer certaines protéines des larmes qui peuvent être adsorbées sur le papier-filtre et non relâchées dans la solution. Une autre technique prometteuse est celle de rincer la surface oculaire avec du sérum physiologique et d’analyser la solution enrichie en protéines [96]. Cette technique est utile pour l’électrophorèse en montrant l’échantillonnage des protéines des larmes et la préservation des bandes d’électrophorèse même après 1 mois de stockage à – 80 C, permettant des analyses supplémentaires si nécessaire [96]. Ces considérations techniques, associées à la nécessité d’avoir un laboratoire expérimenté dans le recueil des larmes et dans les techniques biologiques qui peuvent être appliquées à de petites quantités de produit biologique, restent néanmoins des limites majeures à l’exploration biologique du film lacrymal.
Osmolarité

Quel que soit le type d’œil sec, une donnée commune est l’augmentation de l’osmolarité du film lacrymal, résultant d’une réduction de son volume ou d’une évaporation excessive dans le cas d’un volume normal mais avec un film lacrymal instable. L’osmolarité apparaît donc comme la conséquence terminale des variations de flux du film lacrymal [25] et est un élément de mesure important pour analyser les maladies de la surface oculaire. L’hyperosmolarité a été largement démontrée comme entraînant une atteinte épithéliale, contribuant au développement de la KCS, à la libération de cytokines inflammatoires et stimulant des réactions inflammatoires chroniques [97]. La technique utilise l’osmomètre de Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, New-York, États-Unis), considéré comme l’appareil standard pour l’étude des yeux secs, ou des osmomètres à pression de vapeur [4]. Moins de 1 µL (et parfois des volumes aussi petits que 0,2 µL), pris au niveau du ménisque lacrymal inférieur est nécessaire pour cette technique. L’osmolarité normale est de 304 ± 1,4 mOsm/L mais peut atteindre des valeurs supérieures à      330, alors que l’osmolarité moyenne est augmentée dans la KCS avec une valeur moyenne de 343 ± 32,3 mOsm/L. Une valeur limite à 312 mOsm/L a été proposée pour différencier les yeux normaux des yeux secs, avec une sensibilité de 94,7 % et une spécificité de 97,7 % [98], mais des chevauchements peuvent être observés entre les valeurs normales et les yeux secs au-dessus de 320 mOsm/L. Théoriquement, ce test est utile pour discriminer les yeux secs par insuffisance aqueuse des yeux secs par évaporation.

Néanmoins, la plupart des études n’ont pas réussi à donner une valeur limite pour ces deux atteintes. De plus, l’échantillon de larme pour les mesures d’osmolarité ne prend en compte que le ménisque lacrymal inférieur et non le film lacrymal précornéen. Il est possible que ce compartiment du film lacrymal ait une osmolarité physiologique très élevée, qui serait encore plus augmentée dans les cas de syndromes secs [4]. En conséquence, il y a un risque de sous-estimation avec cette technique, particulièrement en cas de syndrome sec par évaporation, dans lequel la différence entre le ménisque des larmes et le film lacrymal pré-oculaire est encore plus grande. Un nouvel osmomètre des larmes assisté par ordinateur a été utilisé dans une étude clinique et des valeurs identiques à celles trouvées avec d’autres techniques ont été rapportées. Cette méthode serait plus facile, plus rapide et reproductible [99].
Électrophorèse des larmes

La concentration totale en protéines dans les larmes varie entre 6 et 10 g/L, comme le prouve la technique de bleu Coomassie [100]. Les protéines majeures des larmes peuvent être facilement séparées en utilisant les techniques habituelles d’électrophorèse sur gel d’agarose ou gel de sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE). Seulement 5 µL de larmes sont nécessaires pour réaliser une électrophorèse. Une technique isoélectrique focalisée sur le gel d’électrophorèse [101] pourrait aussi augmenter la détermination des protéines des larmes. Plus de 31 bandes d’électrophorèse ont été observées, certaines d’entre elles restant indéterminées à ce jour. L’association avec les techniques d’immunomarquage pourrait également améliorer la détermination et l’identification de ces protéines [102]. Cependant, les techniques d’électrophorèse se concentrent sur les protéines principales du film lacrymal. Les lipocalines, initialement décrites comme formant un pic de protéines appelées pré-albumine spécifique des larmes ou protéines de migration rapide, l’albumine sérique, les IgA sécrétoires, les immunoglobulines totales, la lactoferrine, et le lysozyme peuvent être reconnus comme des bandes de migration spécifiques ou des pics.

En utilisant un gel d’agarose pour l’électrophorèse, quatre pics ont été décrits. Les lipocalines et l’albumine forment le premier pic près de l’anode et représentent 25 à 35 % des protéines totales. Elles sont suivies par un petit pic (6 à 10 %) de protéines indéterminées d’origines sérique et lacrymale, puis par un haut pic, fait de lactoferrine et d’immunoglobulines (28 à 42 %). Le dernier pic correspond à une protéine unique, le lysozyme, qui migre vers la cathode et constitue 20 à 30 % des protéines totales [100]. Dans des cas de syndromes secs liés à la glande lacrymale, plusieurs pics peuvent être diminués selon la sévérité de la maladie. Cette technique pourrait aussi aider au diagnostic des processus inflammatoires, identifiés par l’augmentation des taux de protéines totales, d’albumine et d’immunoglobulines.

Certaines variations des protéines des larmes peuvent être observées dans des analyses répétées, particulièrement l’albumine sérique et les immunoglobulines, alors que la reproductibilité des dosages de lactoferrine, de lipocaline et de lysozyme semble meilleure quelle que soit la technique utilisée et reste stable dans le temps [96]. La comparaison en chromatographie liquide à haute performance (HPLC) entre des larmes provenant des yeux ouverts et celles provenant des yeux fermés, montre des profils protéiques différents, avec une prédominance d’IgA sécrétoires dans les yeux fermés (49 % des protéines totales), alors que les larmes d’origine réflexe sont composées majoritairement de lysozyme [103]. En 1997, Bjerrum a aussi utilisé des techniques d’électrophorèse (SDS-PAGE et Western Blot). Il a proposé le rapport entre les quantités d’albumine et de lactoferrine comme un outil diagnostique pour discriminer le syndrome de Sjögren dans lequel ce rapport supérieur à 2:1 avait une sensibilité à 67 % et une spécificité à 100 % [104].
Dosages spécifiques des protéines lacrymales majeures : lactoferrine et lysozyme

Le lysozyme et la lactoferrine sont deux protéines majeures des larmes, sécrétées par les acini des glandes lacrymales. Elles jouent un rôle très important dans la défense de la surface oculaire contre les microorganismes et possèdent des propriétés anti-oxydantes [105]. Leur diminution dans le film lacrymal est un indicateur intéressant de dysfonctionnement de la glande lacrymale [106]. Les méthodes de dosages standards peuvent être utilisées sur le gel d’agarose, par immunonéphélémétrie, avec des techniques de spectrophotométrie ou de turbidimétrie sur bactéries vivantes, ou par technique ELISA, mais des kits commerciaux ont été développés pour simplifier ces dosages et même les rendre accessibles aux cliniciens pour une analyse semi-quantitative. Ils peuvent être utilisés sur des échantillons de larmes directement recueillis à l’aide de filtres en papier avec une surface standardisée et une durée de collection déterminée (Lactoplate®, JDC, Culemborg, The Netherlands ; Lysoplate® ; Bioxytech®, OXIS International, Portland, OR, États-Unis). De manière intéressante, les bandelettes de test de Schirmer peuvent être conservées à – 20 C et analysées pour le lysozyme par technique colorimétrique même après 5 ans de stockage [107].

La concentration de lysozyme varie entre 1 et 3 mg/mL dans les larmes normales en fonction des techniques de dosage utilisées, mais diminue de manière constante dans les syndromes secs [108]. Elle peut diminuer en fonction de l’âge et du moment de la journée, chaque valeur doit donc être interprétée en fonction d’une population comparable en âge et en fonction des valeurs normales du laboratoire qui doit être habitué à cette technique.

La concentration de lactoferrine a été mesurée par Ohashi et al. [106] à des niveaux moyens de 2,05 ± 1,12 mg/mL, mais diminuée à 0,69 ± 0,55 mg/mL dans les syndromes secs non Sjögren, à 0,13 ± 0,22 mg/mL dans les yeux de syndrome de Sjögren, et à 0,26 ± 0,33 mg/mL dans les yeux de syndrome de Stevens-Johnson. Cette disparité montre le manque de spécificité du dosage de la lactoferrine dans les larmes. Une valeur limite à 1,1 mg/ml a été proposée par Fukuda et Wang [94] avec une sensibilité (79,4 %) et une spécificité (78,3 %) optimales. En 1996, Da Dalt et al. [109] ont comparé la sensibilité et la spécificité du dosage de la lactoferrine avec ceux du test de Schirmer 1, du test de cristallisation, et d’analyses immunologiques du syndrome de Sjögren (anticorps antinucléaires ou biopsie des glandes salivaires accessoires). Ils ont montré que le dosage de la lactoferrine, par la technique de Lactoplate®, et le test de cristallisation étaient les tests les plus sensibles et les plus spécifiques et étaient également mieux corrélés au diagnostic de syndrome de Sjögren que le test de Schirmer 1 [109]. Néanmoins, d’autres auteurs ont fait remarquer le manque de spécificité et de corrélation avec des tests cliniques de l’analyse de la lactoferrine dans les yeux secs légers à modérés [110], [111], reflétant probablement la grande hétérogénéité des syndromes secs en pratique clinique.
Test de cristallisation des larmes

Une caractéristique physique du film lacrymal est la capacité des mucines à cristalliser et à former des aspects en feuilles de fougères quand il est laissé 5 à 10 minutes à sécher à température ambiante et qu’il est observé sous un microscope à contraste de phase ou un microscope polarisé. Ce test simple peut être utile pour l’évaluation qualitative de la production de mucines [112]. Quatre grades ont été décrits (tableau IV). Néanmoins, des précautions doivent être prises pour éviter certains biais d’interprétation de l’aspect en feuilles de fougères, résultant par exemple de particules provenant du maquillage, ou de l’examen des premières gouttes de larmes qui contiennent de très nombreux débris cellulaires. Selon Rolando, les grades I et II sont retrouvés chez 82,7 % des sujets normaux, alors que les grades III et IV sont observés chez 91,7 % des patients avec une KCS [111]. Aucune différence ne semblait être observée entre les hommes et les femmes, mais l’âge pourrait influencer ce test, car la cristallisation est qualitativement altérée après l’âge de 40 ans.
ANALYSE BIOLOGIQUE DU FILM LACRYMAL : TESTS DE RECHERCHE

Une grande variété de protéines, lipides, et marqueurs a été testée à des fins de recherche. Ces techniques avaient comme objectifs principaux d’améliorer les possibilités de dosage dans les larmes, de discriminer l’œil sec d’autres atteintes de la surface oculaire et de déterminer les profils inflammatoires, spécialement depuis qu’un processus inflammatoire infraclinique a été définitivement identifié comme un mécanisme clé dans la KCS [58], [97].
Nouvelles techniques d’identification des protéines des larmes

L’HPLC a été utilisée pour distinguer les protéines des larmes et montre des résultats similaires à ceux obtenus par électrophorèse ou SDS-PAGE [113]. Ces techniques sont néanmoins complexes et dépendent beaucoup de l’échantillon de larmes et des conditions techniques de recueil. Plus récemment, une technique de microchip (Argilent Bioanalyzer System) a été développée pour la séparation et le dosage semi-quantitatif des protéines des larmes. Cette technique automatisée semble être facile à utiliser, économique en temps et montre des résultats similaires à ceux obtenus avec des procédures plus complexes comme le SDS-PAGE [114]. La spectrométrie de masse a aussi été utilisée pour des protéines spécifiques et pour mesurer la substance P dans les larmes [115]. Récemment plus de 400 protéines ont été identifiées dans les larmes grâce à cette technique [116], elle reste cependant une méthode complexe limitée à certains laboratoires spécialisés.
Autres composants des larmes

Le facteur de croissance épithélial (EGF) a un rôle important dans la régulation de la surface oculaire et le renouvellement épithélial. Ce facteur de croissance synthétisé par la glande lacrymale a été retrouvé diminué dans le syndrome de Sjögren [91], [106]. Ohashi et al. [106] ont trouvé des valeurs normales de 5,09 ± 3,74 ng/mL, diminuées à 2,30 ± 3,04 ng/mL et à 0,58 ± 0,60 ng/mL dans les syndromes secs non Sjögren et dans les syndromes de Sjögren, respectivement, mais les niveaux d’EGF étaient encore plus bas dans les cas de syndromes de Stevens-Johnson (0,32 ± 0,16 ng/mL). Ces auteurs ont également testé l’aquaporine 5 en ELISA. Il s’agit d’un canal pour l’eau très exprimé au niveau des membranes apicales des cellules acinaires et ductales des glandes lacrymales mais aussi au niveau de l’épithélium cornéen. Ils ont observé une concentration d’aquaporine 5 quatre fois supérieure dans les larmes des yeux des patients atteints d’un syndrome de Sjögren par rapport aux yeux contrôles, mais avec une grande variabilité et parfois des résultats contradictoires. Les syndromes secs non-Sjögren s’accompagnent également d’une augmentation de la concentration d’aquaporine 5 qui pourrait résulter d’une atteinte cornéenne entraînant la libération de cette protéine dans les larmes à partir de l’épithélium cornéen.

La cystatine, un inhibiteur des protéases contrôlant l’activité protéase de la cystéine, a aussi été retrouvée dans les larmes en utilisant une technique isoélectrique sur gel d’électrophorèse [101]. Les IgA sécrétoires, les lipocalines, et les phospholipases A2 ont été mesurées dans les larmes pour discriminer différents désordres de la surface oculaire. Les lipocalines et les phospholipases A2 ont été retrouvées significativement différentes chez les porteurs de lentilles de contact tolérants et intolérants, et étaient positivement corrélées avec les symptômes subjectifs [111]. Les lipocalines sont des membres d’une famille de protéines liées aux lipides, aux acides gras à longue chaîne, aux glycolipides, aux phospholipides, ou au cholestérol. L’activation des phospholipases dans les maladies de la surface oculaire serait liée aux endotoxines bactériennes ou aux réactions inflammatoires induites par les phagocytes mononucléés. Elle pourrait être également le résultat d’une sécrétion par la glande lacrymale en réponse à un stimulus inflammatoire provenant de la surface oculaire. Une grande concentration de phospholipases dans les larmes peut entraîner une augmentation de la dégradation des lipides ainsi qu’une instabilité accrue du film lacrymal. Les métalloprotéinases (MMP) ont été analysées dans les larmes par la technique de zymographie. La principale MMP retrouvée dans le film lacrymal est la MMP 9, qui semble être synthétisée localement par les granulocytes [117].

Les produits du gène MUC5AC synthétisés par les cellules à mucus ont été analysés en utilisant les bandelettes du test de Schirmer grâce à des techniques d’immunoperoxydase [118]. Les résultats ont montré une concentration diminuée dans les yeux secs, comme pour les résultats d’empreintes conjonctivales, mais la très grande variabilité des niveaux de MUC5AC chez les sujets normaux limite les avantages de cette technique. Les quantités de mucines ont aussi été mesurées en utilisant la technique ELISA [119], elles étaient diminuées dans les syndromes secs par rapport aux yeux normaux, mais aussi chez les patients glaucomateux et chez les porteurs de lentilles de contact.

La technique de chromatographie de haute performance sur couche fine a été décrite pour séparer les principales classes de lipides présentes dans les larmes [120]. Des techniques supplémentaires peuvent être utilisées sur les sécrétions meibomiennes pour différencier la très grande variété de lipides des larmes où peuvent s’associer différentes classes de phospholipides, sphingolipides, céramides, cérébrosides et acides gras. Les acides gras insaturés seraient présents uniquement chez les patients avec un dysfonctionnement meibomien [121].
Les médiateurs inflammatoires

Plusieurs cytokines inflammatoires ont été retrouvées avec succès dans les larmes, dans des états pathologiques mais aussi à l’état normal. L’IL-6 et l’IL-8 ont été retrouvées dans les larmes normales [122]. L’IL-6 a aussi été retrouvée à des niveaux significativement plus élevés dans les larmes de patients avec un syndrome de Sjögren par rapport aux yeux normaux. Les cytokines pro-inflammatoires IL-1 α et IL-1 β ont aussi été retrouvées à des niveaux augmentés dans l’œil sec, comme la MMP-9 matricielle, une enzyme qui clive le précurseur de l’IL-1 β en sa forme active. Ces médiateurs sont corrélés avec la prise de fluorescéine mais ne peuvent pas discriminer entre les maladies des glandes de Meibomius et le syndrome de Sjögren, probablement parce qu’ils ont pour origine, au moins pour une partie, l’épithélium conjonctival [123]. Une activité élevée des plasmines a aussi été retrouvée dans les larmes de patients avec un syndrome de Sjögren, suggérant une activité protéolytique importante probablement associée aux réactions inflammatoires dans les glandes lacrymales et/ou les cellules de la surface oculaire [124].

Le stress oxydant a aussi été recherché dans les larmes de sujets normaux et de patients souffrant de syndromes secs. Les peroxydes lipidiques et l’activité myeloperoxidase ont été déterminés par des analyses spécifiques sur de petites quantités de larmes (4 µL). Des niveaux élevés ont été retrouvés dans l’œil sec, indiquant un stress oxydant et une activité inflammatoire dans cette maladie [125]. Ces tests sont cependant peu discriminants entre les différentes formes de syndromes secs, ceux avec une sécrétion aqueuse de larmes déficiente et ceux qui présentent des symptômes subjectifs mais avec une sécrétion lacrymale préservée. Néanmoins, le stress oxydant peut être augmenté par des réactions inflammatoires et favorisé par la diminution des agents anti-oxydants comme le lysozyme et la lactoferrine. Cette évaluation du stress oxydant au niveau de la surface oculaire reste d’un grand intérêt car il peut devenir dans le futur la cible de nouveaux traitements locaux.

Des auto-anticorps ont aussi été testés dans les larmes de patients avec un syndrome de Sjögren avec la technique ELISA. Des anticorps anti-SSA et -SSB ont été retrouvés dans les larmes comme dans le sérum, mais étrangement certains patients (plus de 4 sur 10 pour la recherche de anti-SSB) montraient des larmes positives, alors que les anticorps correspondants étaient négatifs dans le sérum [126].
LES TESTS DIAGNOSTIQUES : CONTRIBUTION AU DIAGNOSTIC ÉTIOLOGIQUE
Biopsie des glandes salivaires accessoires

La biopsie des glandes salivaires a été proposée pour identifier les infiltrats inflammatoires, l’expression des cytokines inflammatoires, et la destruction des acini typiques du syndrome de Sjögren [49]. Considérant le risque de la biopsie de la glande lacrymale principale, la biopsie des glandes salivaires accessoires par une incision labiale s’est largement imposée avec un faible risque de complications [127]. Les infiltrats de cellules mononucléées et les destructions lobulaires entraînant l’atrophie du tissu glandulaire sont des éléments typiques, proches de ceux observés dans la glande lacrymale principale et bien corrélés au degré de sévérité du syndrome de Sjögren. La cytologie sur empreintes de la muqueuse labiale a aussi été proposée comme un substitut à la biopsie, avec un taux de concordance de 97 % [128].
Auto-anticorps sériques et explorations immunologiques

Des taux élevés d’anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires, spécialement anti-SSA et anti-SSB, ont été retrouvés dans les maladies auto-immunes systémiques. Leur présence dans le syndrome de Sjögren peut précéder les manifestations cliniques. La présence d’anticorps anti-SSA est souvent associée à des manifestations systémiques d’auto-immunité comme les vascularites ou la polyarthrite rhumatoïde [49]. Il a aussi été montré que le syndrome de Sjögren serait associé à l’infection par le virus Epstein-Barr ou à la formation d’anticorps dirigés contre différents antigènes comme le récepteur muscarinique M3 ou l’α-fodrine. Le facteur rhumatoïde et d’autres auto-anticorps peuvent être utiles pour étudier les maladies auto-immunes associées à un syndrome de Sjögren.
CONCLUSION

De très nombreuses techniques sont disponibles pour analyser cliniquement ou biologiquement la stabilité et la composition du film lacrymal ainsi que l’atteinte de la surface oculaire. Beaucoup de ces tests ont été validés et constituent maintenant des méthodes standards pour analyser les maladies de la surface oculaire. Pour d’autres, une validation définitive est encore nécessaire avant la diffusion de leur utilisation, mais ces techniques sont prometteuses et présentent un très grand intérêt en recherche. Toutes ces techniques offrent de nombreuses avancées vers une meilleure compréhension de l’atteinte du film lacrymal dans les désordres de la surface oculaire et constituent une base d’évaluation pour le traitement des patients atteints de syndromes secs.
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