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Dissociation fonctionnelle entre la signalisation et l’endocytose du récepteur de l’apéline : implication dans les effets de l’apéline sur la pression artérielle. - 26/03/08

Doi : AMCV-08-2007-100-8-0003-9683-101019-200600023 

X. Iturrioz [1],

S. El Messari [1],

N. De Mota [1],

C. Fassot [1],

R. Alvear-Perez [1],

B. Maigret [2],

C. Llorens-Cortes [1]

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Résumé

L’apéline, est le ligand endogène du récepteur orphelin humain APJ. Nous avons cloné le récepteur murin homologue de l’APJ, récepteur à sept domaines transmembranaires couplé à la protéine Gi. Nous avons établi une lignée stable de cellules CHO exprimant le récepteur APJ murin étiqueté à son extrémité C-terminale avec l’EGFP. Ce récepteur est couplé négativement à l’adénylate cyclase et s’internalise sous l’action l’apéline 17 (K17F, KFRRQRPRLSHKGPMPF). Afin de caractériser pharmacologiquement et fonctionnellement ce récepteur, nous avons évalué la capacité de différents fragments d’apéline délétés à l’extrémité N- ou C-terminale de K17F à se lier au récepteur, à inhiber la production d’AMPc induite par la forskoline et à induire son internalisation. Les résultats obtenus montrent que la délétion successive des 5 premiers acides aminés N-terminaux ou des deux derniers acides aminés C-terminaux de K17F ne sont pas essentiels pour la liaison de l’apéline à son récepteur ni à la réponse AMPc. A l’inverse la délétion de l’arginine en position six dans K17F diminue drastiquement l’affinité du peptide pour le récepteur ainsi que la réponse AMPc. Concernant l’internalisation du récepteur de l’apéline, les délétions successives à l’extrémité N-terminale de K17F diminuent de façon progressive ce processus alors que la délétion d’un seul acide aminé à l’extrémité C-terminale de K17F (la phénylalanine en position 17) l’abolit. Ces résultats indiquent qu’il existe une dissociation fonctionnelle entre la signalisation du récepteur de l’apéline (couplage Gi) et son internalisation et suggèrent l’existence de différentes conformations actives du récepteur de l’apéline stabilisées par la liaison des différents fragments d’apéline. Pour étudier la répercussion de cette dissociation fonctionnelle sur l’activité biologique, nous avons évalué l’effet de l’injection des différents fragments d’apéline sur la pression artérielle chez le rat Wistar Kyoto normotendu. Ainsi, l’injection par voie intraveineuse de K17F provoque une baisse de la pression artérielle. A l’inverse, l’injection des fragments d’apéline, ne provoquant pas l’internalisation du récepteur mais conservant intacte leur capacité à inhiber la production d’AMPc, n’ont pas d’effet hypotenseur. Ces résultats suggèrent fortement que l’internalisation du récepteur de l’apéline serait à l’origine de l’initiation d’une seconde voie transductionnelle, indépendante des protéines G, impliquée dans l’effet hypotenseur de l’apéline. L’ensemble de ces résultats constitue une première étape dans la caractérisation pharmacologique du récepteur de l’apéline nécessaire au développement d’agonistes biaisés de ce récepteur, capables d’activer une voie de signalisation spécifique. Ces molécules pourraient constituer des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des maladies cardiovasculaires.

Abstract

Functional dissociation between apelin receptor signaling and endocytosis: implications for the effects of apelin on arterial blood pressure.

Apelin is a peptide involved in the regulation of body fluid homeostasis and cardiovascular functions, that was recently isolated as the endogenous ligand for the human orphan APJ receptor, a G protein-coupled receptor which shares 31% amino-acid sequence identity with the angiotensin II type 1 receptor. The predominant molecular forms of apelin naturally occuring in vivo are apelin 36, apelin 17 (K17F) and the pyroglutamyl form of apelin 13 (pE13F).

We investigated the structure-activity relationships of apelin at the rat apelin receptor, tagged at its C-terminal end with enhanced green fluorescent protein and stably expressed in CHO cells. We compared the abilities of N- and C-terminal deleted fragments of K17F (KFRRQRPRLSHKGPMPF) to bind with high affinity to the apelin receptor, to inhibit cAMP production and to induce apelin receptor internalization.

The first five N-terminal and the last two C-terminal amino acids of K17F were not essential for apelin binding or cAMP response. In contrast, deletion of the arginine in position 6 drastically decreased binding and cAMP response. The full-length sequence of K17F was the most potent inducer of apelin receptor internalization because successive N-terminal amino-acid deletions progressively reduced internalization and the removal of a single amino acid, the phenylalanine in position 17 at the C-terminus of K17F abolished this process. Thus, K16P binds with high affinity to the apelin receptor and strongly inhibits cAMP production, but does not induce apelin receptor endocytosis. These data indicate that apelin receptor signaling (coupling to Gi) and endocytosis are functionally dissociated, possibly reflecting the existence of several conformational states of this receptor, stabilized by the binding of different apelin fragments to the receptor. We then investigated the consequences for biological activity of this functional dissociation by evaluating the effects of various apelin fragments, injected iv, on arterial blood pressure in normotensive Wistar Kyoto rats. We showed that apelin fragments, that did not induce receptor internalization in vitro but kept their ability to activate receptor coupling to Gi, did not decrease arterial blood pressure. Our data showed that hypotensive actions of apelin peptides correlate with the ability of those ligands to internalize. Thus, the depressor response of apelin may be controlled by apelin receptor endocytosis, which is probably required for initiation of a second wave of signal transduction. The development of biaised agonists of the apelin receptor capable of promoting only one specific signal transduction pathway may therefore offer new therapeutic avenues for the treatment of cardiovascular disorders.


Mots clés : Apéline , équilibre hydrique , insuffiance cardiaque , HTA , signalisation , endocytose


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Vol 100 - N° 8

P. 704-708 - août 2007 Retour au numéro
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