Introduction et But de l’étude. – L’étude des mécanismes de l’absorption intestinale du cholestérol est nécessaire pour pouvoir révéler de nouvelles cibles de régulation de la cholestérolémie. L’analyse des évènements intracellulaires dans l’entérocyte nécessite l’utilisation d’un marqueur fluorescent mimant le trafic des stérols alimentaires. Nous abordons ici le trafic du 22-nitrobenzoxadiazole-cholestérol (Chol-NBD) dans les cellules Caco-2, modèle classique d’entérocytes différenciés humains, par l’association de mesures de cinétiques d’incorporation cellulaire et d’observations en microscopie de fluorescence.

Matériel et Méthodes. – Les cellules Caco-2/TC7 sont différenciées après 2-3 semaines de culture à confluence, sur support solide ou poreux. Après incubation des cellules pendant un temps variable avec une solution biliaire solubilisant le Chol-NBD, la fluorescence incorporée dans les cellules est mesurée, et sa localisation est observée en microscopie confocale.

Résultats. – Les cellules Caco-2/TC7, différenciées sur support solide, incorporent le Chol-NBD avec une cinétique « en deux vagues ». La première phase d’environ 30 mn augmente avec la concentration du Chol-NBD, et dépend de la présence de cholestérol et de la composition de la solution biliaire utilisée pour délivrer le Chol-NBD ; la seconde phase, qui dépend moins des conditions expérimentales, n’est pas encore saturée à 180 min. Après cette incubation, le Chol-NBD est surconcentré 30 fois environ dans les cellules par rapport au milieu donneur, compatible avec une accumulation de Chol-NBD estérifié, déjà décrite dans la littérature. Ces données cinétiques indiquent que le Chol-NBD est incorporé dans les cellules Caco-2/ TC7 par un mécanisme rapide, spécifique et de grande capacité.

L’observation confocale en microscopie de fluorescence des mêmes cellules Caco-2/TC7 montre des structures, plus intensément marquées à 2 h qu’à 15 min d’incubation, considérées comme des « gouttelettes lipidiques » du fait de leur marquage par l’Oil Red O et de la présence révélée par immunofluorescence des protéines caractéristiques adipophiline, cavéoline-2 et ApoB. Du fait de l’exaltation du rendement quantique de fluorescence du groupement NBD en milieu hydrophobe, le Chol-NBD, après estérification, est un bon marqueur de ces gouttelettes lipidiques. Lorsque les cellules Caco-2/TC7 sont cultivées sur support poreux, on observe un comarquage par le Chol-NBD et l’ApoB au niveau des évaginations cellulaires dans les pores du support, compatible avec une sécrétion rapide du Chol-NBD dans un complexe lipoprotéique. De plus, la relocalisation basale de l’ApoB, initialement apicale, est similaire à celle induite par une incubation avec une solution biliaire contenant du cholestérol à la place du Chol-NBD, ce qui indique que le Chol-NBD est un bon analogue métabolique du cholestérol.

Conclusions. – Ces données indiquent que le Chol-NBD a un comportement assez analogue à celui du cholestérol pour ce qui est de son incorporation entérocytaire, de son inclusion dans des gouttelettes lipidiques après estérification, de sa capacité à induire la relocalisation d’ApoB, et de sa sécrétion sous forme de complexes lipoprotéiques.