Pneumocystis jirovecii est un champignon opportuniste responsable d’infections pulmonaires sévères chez les patients immunodéprimés. Le diagnostic biologique de ces pneumonies à P. jirovecii (PcP) repose sur des techniques microscopiques, ou, plus sensible, sur la détection d’ADN de P. jirovecii par PCR quantitative dans les prélèvements respiratoires. Le contexte clinique, l’existence de nombreux diagnostics différentiels et la toxicité du traitement nécessitent une réponse à la fois rapide et fiable. Dans cette optique, nous avons adapté notre PCR maison en temps réel ciblant le gène MSG sur la plateforme de biologie moléculaire entièrement automatisée BD Max™ (Becton Dickinson) qui permet l’analyse au fil de l’eau des prélèvements adressés pour suspicion de PcP.

La technique a été développée à partir de la PCR utilisée au laboratoire (Chumpitazi, Med Mycol, 2011) et des données de la littérature (Dalpke, JCM, 2013). L’ensemble des étapes, extraction et amplification, est réalisé automatiquement et sans interruption sur l’automate BD Max™ et nécessite un temps technique estimé à <10minutes/échantillon. Pour l’extraction, le kit BD MAX™ ExK™ DNA-1 a été utilisé, soit directement à partir du prélèvement respiratoire (lavage broncho-alvéolaire [LBA] ou broncho-aspiration [BA] peu visqueuse), soit après fluidification (Digest-EUR^®, Eurobio) et centrifugation du prélèvement (BA visqueuse). Le kit BD MAX™ DNA MMK (SPC), auquel ont été ajoutées les amorces et sonde spécifiques du gène ciblé, a été utilisé pour l’amplification et la détection du gène MSG et du contrôle interne d’extraction et d’amplification. Une courbe standard de quantification a été réalisée à partir de dilutions successives d’un plasmide contenant le gène MSG. Les Ct et charges fongiques obtenus avec la technique BD Max ont été comparés rétrospectivement aux résultats obtenus avec la technique utilisée jusqu’ici au laboratoire.

La technique développée sur la plateforme BD Max™ permet l’extraction d’ADN, l’amplification et la détection du gène MSG et d’un contrôle interne, ainsi que la quantification de la charge fongique en moins de 2heures à partir d’un prélèvement respiratoire, grâce à une automatisation quasi-complète. Les seules étapes manuelles consistent en la préparation du mélange sondes et amorces (mais celui-ci peut être préparé à l’avance, aliquoté et congelé) et le prétraitement des échantillons visqueux. Les performances analytiques (sensibilité, limite de détection), ainsi que les Ct obtenus sur cette plateforme, sont comparables à ceux de la précédente technique.

Par sa simplicité d’utilisation, la possibilité d’être réalisée à la demande et un délai de rendu de résultat inférieur à 2heures, cette technique répond à l’urgence diagnostique de la PcP de l’immunodéprimé, et est vouée à remplacer le diagnostic microscopique. Une étude prospective, sur un plus grand nombre d’échantillons, est en cours : elle permettra notamment de déterminer les seuils de charge fongique permettant de distinguer colonisation et infection par Pneumocystis jirovecii.