Développement d’une approche originale de cytométrie en flux pour préciser le caractère pathogène des mutants d’ARMC5 (armadillo repeat containing 5) identifiés dans l’hyperplasie macro nodulaire bilatérale primitive des surrénales - 07/09/16
Résumé |
Introduction |
Une mutation germinale inactivatrice du gène ARMC5 est retrouvée à l’état hétérozygote chez 25 % des patients présentant une hyperplasie macro nodulaire bilatérale primitive des surrénales (HMBPS). À ce jour, 69 mutations ont été identifiées (données personnelles et de la littérature). La pathogénicité des mutations faux-sens d’ARMC5 doit être étudiée. Les premières études suggèrent un rôle pro-apoptotique de la protéine ARMC5 sauvage (ARMC5-WT), altéré chez les mutants. Pour quantifier l’apoptose induite par ARMC5-WT et ses variants, une approche de cytométrie en flux a été mise au point qui mesurait, après fixation, la fluorescence émise par un anticorps anti caspase-3, dans une population surexprimant ARMC5. Nous travaillons à une procédure simplifiée sur cellules vivantes.
Méthode |
Trois lignées cellulaires -HeLa, HEK, H295R- sont transfectées avec un vecteur d’expression étiqueté GFP (pIRES-EGFP2), permettant la surexpression d’ARMC5-WT ou d’un mutant connu pathogène : p.L548P. Une construction sans ARMC5 est transfectée en contrôle. L’apoptose est étudiée dans les HeLa à 12, 14 et 20h de transfection en utilisant le marqueur membranaire annexine-V conjugué au fluorochrome Alexa-647mm. Acquisitions sur accuri-C6.
Résultats |
L’apoptose des cellules HeLa surexprimant ARMC5-WT semble être un phénomène précoce, observable dès 14h de transfection et qui n’est pas induit par la surexpression du mutant p.L548P (respectivement 25, 35 et 23 % de cellules annexine-V positives dans les groupes contrôle, ARMC5-WT et ARMC5-muté p.L548P). Ces résultats doivent être confirmés. La procédure est à tester dans les HEK et les H295R.
Perspectives |
Ce protocole devrait être appliqué aux mutations faux-sens d’ARMC5 pour préciser leur caractère pathogène.
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Vol 77 - N° 4
P. 266 - septembre 2016 Retour au numéroBienvenue sur EM-consulte, la référence des professionnels de santé.