Proposer une méthode d’extraction et de validation pour le screening sanguin par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS) avec une mise en application à un décès par injection accidentelle d’atracurium.

La mise au point de l’extraction et la validation ont été réalisées avec des contrôles de qualité interne (CQI), comprenant 10 molécules (amiodarone, cyamémazine, diazépam, MDMA, hydroxyzine, mirtazapine, morphine, nordiazépam, propranolol et venlafaxine). Ces molécules ont été choisies en fonction de leur rapport m/z, de leur temps de rétention, de leur classe thérapeutique et de leur mode d’ionisation. Trois niveaux de concentration (2,20 et 100ng/mL) ont été analysés par UPLC-HRMS avec un système Waters Xevo-G2 XS Qtof sur une colonne acquity UPLC^® HSS C18, 1,8μm. Plusieurs méthodes d’extraction ont été étudiées, l’extraction en phase solide (SPE), l’extraction en phase liquide (LLE), l’extraction liquide–liquide sur support solide (SLE) et la déprotéinisation. L’efficacité de chaque extraction a été évaluée en comparant le nombre de molécules extraites et l’aire des pics. L’aire du pic a été utilisée pour mesurer la répétabilité et la fidélité intermédiaire (FI) puisque la méthode est uniquement qualitative. La méthode finale a été utilisée pour l’analyse d’un échantillon sanguin d’un patient ayant reçu accidentellement de l’atracurium à la place de la trimébutine.

L’étude a montré que l’intensité du pic pour la SPE, la LLE et la déprotéinisation est satisfaisante. Avec la SPE et la LLE des aires plus importantes sont obtenues pour la plupart des molécules, en moyenne 30 % supérieures aux aires obtenues par déprotéinisation pour un CQI à 100ng/mL, sauf pour l’amiodarone, pour laquelle l’intensité est 10 fois moins importante. Les résultats de l’extraction SLE n’étaient pas satisfaisants car les aires obtenues étaient en moyenne 100 fois inférieures. La répétabilité et la fidélité intermédiaire (FI) ont été calculées sur les trois niveaux de CQI par la méthode de déprotéinisation finalement retenue. Les coefficients de variation ont été calculés à partir des aires des pics (Tableau 1). Les résultats de l’amiodarone ne figurent pas dans le tableau car les CV de la répétabilité étaient en dehors des limites d’acceptabilité fixées par le laboratoire, qui sont de 40 % pour le CQI_bas, 30 % pour le CQI_moy et 20 % pour le CQI_haut [1Telving R., et al. Targeted toxicological screening for acidic, neutral and basic substances in post-mortem and antemortem whole blood using simple protein precipitation and UPLC-HR-TOF-MS Forensic Sci Int 2016 ;  266 : 453-461 [cross-ref]

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Étant donné que cette molécule est éluée à la fin du gradient (95 % acétonitrile), il est possible que les interférences matricielles posent un problème pour l’ionisation. Les résultats du screening appliqué à notre cas montrent qu’aucune trace de trimébutine (masse 387,2046g/mol) n’a été retrouvée dans le sang périphérique, tandis qu’un pic de laudanosine (métabolite de l’atracurium) a été mis en évidence, confirmant l’erreur d’administration.

La méthode d’extraction retenue pour le screening sanguin est la déprotéinisation. L’intensité des pics était moins importante mais l’objectif était de trouver une méthode simple, rapide et efficace pour optimiser le rendu des résultats et leur fiabilité. Pour les résultats obtenus, seule l’amiodarone a un CV supérieur aux limites fixées par le laboratoire, citées précédemment, quelle que soit la méthode d’extraction. Cette méthode a été utilisée avec succès pour confirmer une erreur d’administration médicamenteuse.