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Évaluation de la détermination du statut Rhésus-D fœtal sur plasma maternel par la technique d’hemi-nested PCR - 10/03/08

Doi : JGYN-11-2006-35-7-0368-2315-101019-200604300 

D. Dif-Couvreux [1],

V. Houfflin-Debarge [1],

A. Delsalle [2],

S. Dourieux [2],

S. Dubreucq [1],

L. Manessier [2],

F. Puech [1]

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Résumé

Objectif. Le but de notre étude est d’évaluer la faisabilité de la détermination du statut Rhésus-D (RhD) fœtal sur plasma maternel par la technique d’hemi-nested PCR conventionnelle.

Matériel et méthodes. Après consentement éclairé et signé, un prélèvement sanguin a été réalisé chez 99 patientes D-négative bénéficiant d’une amniocentèse dans le cadre d’un diagnostic prénatal ou lors d’un bilan sanguin systématique en consultation prénatale. L’ADN fœtal, extrait à partir de 400 µL de plasma maternel, a été analysé en parallèle par deux opérateurs différents grâce à une hemi-nested PCR amplifiant une région de l’exon 10 du gène RhD. Les résultats ont été comparés au statut RhD fœtal obtenu après détermination par PCR sur liquide amniotique ou par analyse sur sang des nouveau-nés après l’accouchement.

Résultats. Sur les 99 patientes D-négatives étudiées, toutes Caucasiennes, 47 ont été prélevées au cours du second trimestre et 52 au troisième trimestre (médiane : 27,20 semaines d’aménorrhées +/– 8,25). Soixante-six fœtus étaient D-positifs et 30 D-négatifs. La sensibilité et la spécificité de notre technique étaient respectivement de 100 % et 86,7 %. Quinze pour cent de résultats discordants ont été observés entre les deux opérateurs. Quatre faux positifs ont été observés. Après analyse des phénotypes maternels, un seul cas de non expression du gène RhD fœtal a été suspecté en raison du phénotype fœtal particulier retrouvé (ddCcEe).

Conclusion. La technique d’hemi-nested PCR conventionnelle pourrait être utilisée dans la détermination du statut RhD fœtal sur plasma maternel. Cependant, cette technique est difficilement applicable en routine en raison de la nécessité de conditions techniques très strictes. C’est pourquoi, l’utilisation de technique de PCR quantitative en temps réel est préférable. Mais quelque soit la technique utilisée, l’existence d’un polymorphisme du gène RhD ne doit pas être méconnu. Certains faux négatifs pourraient être expliqués par la présence de réarrangement sur le gène RhD et certains faux positifs expliqués en raison d’un gène RhD non fonctionnel.

Abstract

Evaluation of conventional hemi nested PCR analysis for fetal RHD determination in maternal plasma.

Aims. The aim of our study was to evaluate the possibility of identifying the fetal RhD status in maternal plasma using conventional hemi nested PCR analysis.

Subjects and methods. After informed written consent, 20 mL of peripheral blood were collected in 99 D-negative pregnant women either at an amniocentesis for prenatal diagnosis or at a prenatal checkup. Fetal DNA extracted from 400 µL of maternal plasma was analyzed by two different operators with a hemi-nested PCR extending an area of the RhD gene exon 10. The results were compared to the fetal RhD status obtained by PCR amniotic fluid analysis or blood analysis of newborns after delivery. The influence of mother’s and baby’s phenotype were also studied.

Results. Among the 99 D-negative pregnant women, all Caucasian, 47 were in their second trimester and 52 in their third trimester (mean: 27.20 weeks of gestation +/–8.25). Sixty-nine fetuses were D-positive and thirty D-negative. The sensitivity and specificity of our technique were respectively 100% and 86.7% and 15% of discordant results were observed between the two operators. Four false positives were observed. According to maternal phenotype, a fetal unexpressed RHD gene was suspected in only one case because of a particular fetal phenotype (ddCcEe).

Conclusion. A conventional hemi nested PCR analysis of maternal plasma could be used for accurate fetal RhD status. However this procedure is difficult to apply for routine analysis because of the importance of anti-contamination measures required to obtain good results. Real time quantitative PCR analysis on fetal DNA is more suitable. Whatever the operating procedure used, polymorphism of RhD gene may follow in either false negative from presence of rearranged gene or false positive from occasional presence of a non functional RHD gene.


Mots clés : AND fœtal libre dans le plasma maternel , Statut fœtal RhD , Gène RhD

Keywords: Cell-free fetal DNA in maternal plasma , Fetal RhD status , RhD gene


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Vol 35 - N° 7

P. 658-664 - novembre 2006 Retour au numéro
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