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PCR multiplex sur le LightCycler utilisant des sondes d'hydrolyse et d'hybridation : application à la quantification du provirus VIH-1 - 01/01/01

G  Barguès,  K  Brengel-Pesce,  P  Morand,  M  Burgard 1

1  laboratoire de virologie, hôpital Necker, Paris.

,  C  Rouzioux 1 ,  JM  Seigneurin

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Résumé

L'efficacité virologique des multithérapies antirétrovirales est actuellement définie par la réduction durable et forte de la charge virale plasmatique (ARN VIH). La quantification de l'ADN proviral apporte une information complémentaire sur les réservoirs du virus dans l'organisme. Nous avons mis au point une PCR quantitative en temps réel du provirus VIH-1 (amorces et sonde consensus ANRS-AC11) dans les cellules mononucléées sanguines en utilisant le LightCycler. La stratégie élaborée associe une sonde d'hydrolyse de type TaqMan pour la quantification du VIH-1 et des sondes d'hybridation fluorescéine/Red 705 pour la détection d'un contrôle interne d'amplification (gène β-globine).

Les résultats de cette étude montrent que la coamplification avec le gène de la β-globine n'interfère pas avec la quantification du VIH-1 et que la sensibilité est de 5 copies pour la PCR VIH-1. Nous obtenons une bonne corrélation avec une technique de PCR compétitive (δ LOG = 0, 19). La possibilité d'utiliser simultanément une sonde d'hydrolyse et des sondes d'hybridation permet d'élargir les capacités d'analyses du LightCycler pour d'autres applications.

Mots clés  : provirus VIH-1 ; Quantification ; LightCycler ; PCR multiplex.

Abstract

Quantification of HIV provirus DNA by aid of PCR multiplex using LIGHT Cycler. The quantitation of HIV provirus DNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) may be useful to gain insight into the natural history of infection and the continued efficacy of antiretroviral therapy. A quantitative PCR with the Light Cycler strategy has been developed to evaluate HIV DNA in PBMCs together with the amplification of cellular gene (β-globin) used as an internal control. Fluorescent hydrolysis probe and hybridization probes were used to detect HIV DNA and the β-globin sequence, respectively, in the same run. Co-amplification with β-globin did not interfere with HIV-1 quantification and the sensitivity of HIV detection was 5 copies. This assay was compared with an HIV DNA competitive PCR and the correlation between the two methods was good (δ LOG = 0.19). The possibility to use simultaneously fluorescent hydrolysis and hybridization probes enlarges the analytic ability of real time PCR LightCycler technology.

Mots clés  : HIV-1 provirus ; quantification ; LightCycler ; multiplex PCR.



© 2001  Publié par Elsevier Masson SAS.

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Vol 16 - N° 2

P. 113-118 - mars-avril 2001 Retour au numéro
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