Le diagnostic du rejet en transplantation rénale est histologique avec, pour le rejet cellulaire, la présence de cellules inflammatoires dans l’interstitium rénal avec lésions de tubulite, et, pour le rejet humoral, la présence de cellules inflammatoires dans les capillaires glomérulaires et péritubulaires. La composition exacte de l’infiltrat et sa localisation précise sont difficiles à analyser sur une même lame de biopsie. Nous avons voulu tester une nouvelle technique d’immunofluorescence multiparamétrique réalisable sur biopsies fixées pour détecter jusqu’à quatre types cellulaires sur la même lame.

Par technique d’ immunofluorescence multiparamétrique, nous avons marqué les cellules NK, les macrophages, les lymphocytes T et les cellules endothéliales à l’aide des anticorps anti-NKP46, CD163, CD3 et CD34 respectivement, au sein de 20 biopsies de rejet humoral, 20 biopsies de rejet cellulaire et cinq biopsies normales. Les images ont ensuite été scannées et les cellules quantifiées de manière automatique, et leur localisation intra- ou extravasculaire déterminée. Parallèlement, nous avons marqué et quantifié les cellules NK avec l’anticorps anti NKP46 par technique d’immunohistochimie classique et également quantifié les transcrits relatifs aux cellules NK, lymphocytes T et macrophages à partir de 26 biopsies congelées par polymerase chain reaction quantitative en temps réel.

La quantification des cellules NK par technique d’ immunohistochimie classique était significativement corrélée à la quantification automatique par technique d’ immunofluorescence multiparamétrique (r=0,91, p<0,001). En outre, la quantification des cellules NK, lymphocytes T et macrophages par immunofluorescence multiparamétrique était également corrélée à l’expression des transcrits (r>0,46, p<0,021). Par immunofluorescence multiparamétrique, les lymphocytes T et les macrophages étaient les deux populations cellulaires prédominantes impliquées dans le rejet (48,0±4,4 % et 49,3±4,4 % respectivement dans le rejet humoral ; 51,8±6,0 % et 45,3±5,8 % dans le rejet cellulaire), bien que nous ayons constaté une répartition très hétérogène dans la composition cellulaire. Les cellules NK étaient rares à la fois dans le rejet cellulaire et dans le rejet humoral (2,9±0,6 % et 2,7±0,7 %). Le compartiment intravasculaire était composé principalement de lymphocytes T, dans les deux types de rejet. Cependant la densité de cellules NK et de macrophages intravasculaire était plus importante dans le rejet humoral que dans le rejet cellulaire.

L’immunofluorescence multiparamétrique est une technique fiable permettant l’étude précise de la composition cellulaire et sa localisation sur biopsies fixées et incluses en paraffine.

The exact composition and localization of the inflammatory burden during allograft rejection is difficult to analyse on the same biopsy slide. We tested the feasibility of detecting four distinct markers in a same paraffin-embedded tissue section from human kidney allograft rejection by using an innovative process of multiplex immunofluorescence.

Kidney allograft biopsies from 20 antibody-mediated rejection, 20 T cell-mediated rejection and five non rejection were labelled against NKp46, CD163, CD3, and CD34 respectively for NK cells, macrophages, T cells and endothelial cells. Images were scanned and cells were automatically quantified and their extra- or intravascular location determined. Conventional immunohistochemistry against NKp46 with manual quantification and real time quantitative polymerase chain reaction for evaluation of the relative messenger ribonucleic acid (mRNA) expression levels of NK, T cell and macrophage transcripts were simultaneously performed.

Multiplex immunofluorescence cell quantification was strongly correlated to manual quantification by immunohistochemistry (r=0.91, P<0.001) and to mRNA expression levels (r>0.46, P<0.021). T cells and macrophages were the two predominant populations involved in rejection (48.0±4.4% and 49.3±4.4% in antibody-mediated rejection; 51.8±6.0% and 45.3±5.8% in T cell-mediated rejection respectively) despite an important heterogeneity in the composition of the inflammatory burden. NK cells constituted a rare population for both T cell-mediated rejection (2.9±0.6%) and antibody-mediated rejection (2.7±0.7%). The intravascular compartment was mainly composed of T cells, including during antibody-mediated rejection. However, NK cells and macrophages densities were significantly higher in capillaries during antibody-mediated rejection.

Multiplex immunofluorescence staining is a reliable technology allowing studying the exact composition and localization of the inflammatory burden during kidney allograft rejection.