L’ypérite (ou gaz moutarde) est un toxique de guerre appartenant à la famille des vésicants causant de graves brûlures cutanées, et possédant également une toxicité oculaire, pulmonaire et systémique. De plus, cet agent entraîne des effets à long terme, physiques, psychiques, et possède un pouvoir carcinogène et mutagène. Cet alkylant bifonctionnel réagit rapidement avec des biomolécules nucléophiles telles que l’ADN, les protéines et le glutathion. La mesure non-invasive de biomarqueurs dans l’urine ou le sang est nécessaire pour diverses raisons : l’établissement de la preuve de contamination, le diagnostic et le pronostic médical en cas de blessure avec d’anciennes munitions ou d’attaques terroristes.

Ainsi, nous avons mis en place une approche analytique basée sur un couplage entre chromatographie liquide et spectrométrie de masse en mode tandem (UHPLC-MS/MS) pour quantifier des dérivés du 2-chloroéthyl éthyl sulfure (CEES), l’analogue monofonctionnel de l’ypérite. Pour mettre au point une méthode spécifique et quantitative, les standards des biomarqueurs d’intérêt ont été synthétisés. Une première classe de marqueurs potentiels sont les dommages à l’ADN. L’adduit Guanine-CEES a donc été synthétisé. Pour notre second type de cibles, nous avons tiré parti du fait que les molécules électrophiles telles que l’ypérite et le CEES se lient, par voie chimique ou enzymatique, à un tripeptide présent en forte quantité dans les cellules, le glutathion. Le conjugué Glutathion-CEES ainsi généré est ensuite métabolisé pour donner successivement les conjugués Cystéine-CEES et N-acétylcystéine-CEES. Nous avons synthétisé ces molécules standards ainsi que leurs dérivés marqués par des isotopes stables. Ces étalons internes permettent de travailler en dilution isotopique par détection en spectrométrie de masse. La préparation de l’échantillon biologique, pour purifier et concentrer les biomarqueurs, est basée sur l’extraction sur phase solide (Solid Phase Extraction, SPE). Une phase polymérique hydrophobe à capacité de charge élevée, de 100mg est utilisée. Le protocole optimisé permet d’avoir des rendements de récupération entre 60 % et 100 %.

Grâce à la méthode analytique développée, nous avons pu quantifier l’adduit Guanine-CEES à la fois dans l’ADN et dans le milieu de culture de cellules HaCaT (lignée de kératinocyte) exposées au CEES. Les conjugués du glutathion et de la cystéine au CEES sont bien détectés dans le milieu de culture. Des expériences similaires ont été faites sur des explants de peau humaine « fraîche ». Les LOQ dans les milieux de culture se situent entre 20 et 120fmol en fonction du biomarqueur. Ces expériences in vitro montrent que les biomarqueurs choisis sont biologiquement pertinents puisque produits dans les cellules puis excrétés dans le milieu extracellulaire. Ce sont donc de bons candidats pour un diagnostic non-invasif. En partant de cette méthode validée, une comparaison entre la SPE « manuelle » et la SPE on-line a été faite. Ce traitement d’échantillon « en ligne » est très intéressant car le volume d’échantillon biologique est faible, il permet également un gain de temps important car la préparation prend environ 20min au lieu de 7h. La SPE on-line permet d’obtenir de meilleures limites de quantification (entre 9 et 33 fmol) et moins de variabilité. La purification de l’échantillon est améliorée par une séparation orthogonale i.e. l’échantillon est lavé sur une phase PentaFluoroPhényle (PFP) avant d’être séparé sur une colonne C18. Ainsi, il a été possible de détecter et quantifier des biomarqueurs dans le plasma de souris intoxiquées au CEES jusqu’à 14jours après exposition.

Cette préparation en ligne d’échantillons biologiques, sang et urine, permet de diagnostiquer rapidement des contaminations au CEES. L’extension à l’ypérite se fera par la synthèse des composés standards correspondant et simple adaptation de la méthode analytique.