Objectives: Croatian Institute of Transfusion Medicine (CITM) implemented non-invasive fetal RHD genotyping as a request for targeted antenatal anti-D prophylaxis. The diagnostic performance of in-house RT-PCR method for fetal RHD genotyping and preliminary results are analyzed.

Materials and methods: Evaluation included results of RHD genotyping for 205 RhD negative pregnant women, 12-36th week of gestation, whose samples were received in period between 2015 and 2020. QIAsymphony SP DSP Virus Midi Kit was used for cffDNA extraction on QIAsymphony SP platform (Qiagen, Germany). Fragments of RHD exons 7 and 10 and later exon 5 were RT-PCR amplified. As internal controls, amplification of SRY gene or RASSF1A fragment and β-actin genes digested with BsTUI were used.

Results: We identified 70.72% (145/205) positive and 28.78% (59/205) negative fetal RHD genotypes. We had one inconclusive result (0.50%) due to the interference of maternal DNA with variant genotype RHD*09.02.00/01/*01N.01. When compared to newborns RhD phenotypes, no false negative and three false positive results (3/199, 1.50%) were observed. The test yielded 100% sensitivity and 95.08% specificity, while diagnostic accuracy was 98.48%. We were able to determine one case of fetal variant genotype RHD*04.04/*01N.01 inherited from the father. The negative and positive predictive test values were 100% and 97.86%, respectively.

Conclusion: Automated cffDNA extraction and RT-PCR amplification of fetal RHD exons 5,7,10 and fragments of SRY, RASSF1A genes represents highly reliable system for determining fetal RHD status which enables targeted antenatal anti-D prophylaxis. To obtain high specificity of cffDNA extraction, strict and thoroughly cleaning procedures are required.

Buts/Objectifs: L'Institut croate de médecine transfusionnelle (CITM) a mis en œuvre un génotypage non invasif de RHD foetal dans le cadre d'une demande de prophylaxie anténatale ciblée anti-D. Les performances diagnostiques de la méthode locale par RT-PCR pour le génotypage RHD foetal et les résultats préliminaires sont analysées.

Matériels et méthodes: L'évaluation comprenait les résultats du génotypage RHD pour 205 femmes enceintes RhD négatives, dans la 12ème à 36ème semaine de gestation, reçues entre 2015 et 2020. Le kit QIAsymphony SP DSP Virus Midi a été utilisé pour l'extraction de l'ADNcff sur la plateforme QIAsymphony SP (Qiagen, Allemagne). Des fragments des exons RHD 7 et 10 et plus tard de l'exon 5 ont été amplifiés par RT-PCR. Comme contrôles internes, on a utilisé le gène SRY ou les gènes RASSF1A et β-actine digérés par BstUI.

Résultats: Nous avons identifié 70,72% (145/205) génotypes RHD fœtaux positifs et 28.78% (59/205) négatifs, et un résultat non concluant (0,50%) en raison de l'interférence de l'ADN maternel avec la variante génotype RHD*09.02.00/01/*01N.01. Par rapport aux phénotypes RhD des nouveau-nés, aucun faux négatif et trois faux positifs (3/199, 1,50%) ont été observés. La méthode montre une sensibilité de 100% et une spécificité de 95,08%, une précision de diagnostic de 98,48%. Nous avons pu déterminer un cas de génotype fœtal variant RHD*04.04/*01N.01 hérité du père. Les valeurs de test prédictives négatives et positives étaient de 100% et 97,86%.

Conclusion: L'extraction automatisée d'ADNc et l'amplification par RT-PCR des exons 5, 7 et 10 de RHD fœtaux et des fragments des gènes SRY et RASSF1A représentent un système hautement fiable pour déterminer le statut RHD fœtal. Pour obtenir une spécificité élevée de l'extraction de l'ADNcff, des procédures de nettoyage strictes et minutieuses sont nécessaires.