Identification d’anticorps monoclonaux dans des échantillons saisis à l’aide de méthodes analytiques complémentaires permettant de démontrer sans ambiguïté l’identité de la protéine étudiée et de distinguer d’éventuelles traces de dégradations.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) connaissent un succès incontestable comme agents thérapeutiques. Comme les médicaments classiques, ces mAbs font l’objet d’un trafic basé sur la fourniture et le recel de produits détournés ou de contrefaçons. Face à l’émergence de ce trafic, il est indispensable de pouvoir analyser des échantillons suspects afin d’identifier la présence et la nature des mAbs spécifiés et de déceler d’éventuelles altérations. Six échantillons suspects ont été saisis par l’unité de douane judiciaire de Paris chez un particulier. Ces échantillons étaient identifiés comme des flacons correspondant à deux types de mAbs différents (mAbs1 et mAbs2), tous deux utilisés dans le traitement de mélanomes avancés. Les emballages et conditionnements des flacons étaient en langues étrangères. Nous avons procédé à l’analyse des échantillons par 3 méthodes différentes en utilisant les produits commerciaux, fournis par les fabricants comme références :

– CZE-UV (PACE MDQ™, Sciex separations) équipé d’un capillaire en silice fondu (électrolyte : 600mM acide amino-caproïque, HPMC 1 %, TETA 2mM/voltage −20kV) afin de fournir une identification du mAbs basée sur la mobilité électrophorétique ;

– par SEC-UV (HPLC 1200™, Agilent Technologies) sur une colonne BioZen™ 1,8μm SEC-3 (300×4,6mm) avec une phase mobile 150mM tampon phosphate/600mM NaCl ;

– enfin pour chaque échantillon, une carte peptidique a été réalisée par digestion enzymatique suivie d’une analyse UPLC-MS/MS haute résolution (Water Acquity UPLC™, Thermo Fischer LTQ orbitrap XL™) équipé d’une colonne BEH C18™ (150×2,1mm, 1,8μM, Waters) avec un gradient de phases mobile H2O/ACN (0,1 % FA) avec un débit de 0,1mL/min, représentant une durée d’analyse totale de 60min.

L’identification des peptides a été réalisée à l’aide du logiciel Biotools™ (Bruker Daltonics) complétée par une confirmation manuelle systématique permettant d’attribuer par une approche orthogonale et extrêmement détaillée l’identité de la protéine.

Pour les deux mAbs, les résultats obtenus en CZE-UV ont montré de manière systématique des temps de migration ainsi que des électrophérogrammes similaires entre produits de références et échantillons inconnus. Les temps de migration étaient respectivement de 11,1 et 8,0min pour les mAbs1 et mAbs2 prouvant que le temps de migration est spécifique pour un mAbs donné. Les échantillons ont été analysés par SEC-UV afin de déceler d’éventuelles traces d’agrégation. Les chromatogrammes obtenus se sont avérés en accord avec les produits de référence ne laissant pas apparaître de traces significatives d’agrégation. Les chromatogrammes obtenus ont également été utilisés pour estimer la concentration en mAbs des échantillons inconnus ; 24,84mg/mL pour mAb1 mAb2 4,58mg/mL, pour des concentrations attendues de 25 et 5mg/mL, respectivement. Les cartes peptidiques ont permis d’identifier la quasi-totalité des séquences d’acides aminés avec un recouvrement supérieur à 90 %, confirmant sans ambiguïté l’identification des mAbs présents dans les flacons. Compte tenu des peptides identifiés les protéines composant les échantillons n’avaient aucune possibilité de correspondre à des protéines différentes des mAbs recherchés.

Les mAbs sont des glycoprotéines complexes dont l’analyse fine exige une stratégie basée sur différentes techniques analytiques complémentaires. La stratégie analytique multi-niveau développée a permis d’identifier sans ambiguïté les mAbs mentionnés dans les échantillons suspects. L’absence significative d’agrégats observée par SEC-UV est témoin de la bonne conservation des flacons. Les analyses CZE-UV et UPLC-MS/MS se sont révélées spécifiques et permettent de confirmer l’identification des mAbs par des principes physicochimiques différents, en plus d’une comparaison avec le produit de référence, mettant en avant dans ce cas un recel de produits pharmaceutiques détournés.