Objectif : Évaluer la faisabilité et l’intérêt de la combinaison de 3 modalités d’imagerie multi-photonique non linéaire – la fluorescence à deux photons (FDP), la génération de seconde harmonique (GSH) et la génération de troisième harmonique (GTH) – comme méthode d’imagerie de la cornée et du trabéculum.

Matériels et Méthodes : Étude in vitro sur 10 cornées de la Banque Française des Yeux montées sur une chambre artificielle, et 10 cornées obtenues après kératoplastie perforante, montées à plat. Un faisceau laser (laser femtoseconde titane-saphir) de longueur d’onde variable (λ = 700-1 250 nm) et d’énergie faible a été focalisé dans les échantillons afin de produire la FDP (380-620 nm), la seconde harmonique (λ/2 = 600 nm) et la troisième harmonique (λ/3 = 400 nm). La fluorescence et les harmoniques épi-diffusées et rétrodiffusées ont été détectées par deux photomultiplicateurs.

Résultats : Les 3 modes de contraste sont hautement complémentaires. La FDP permet de visualiser le cytoplasme des cellules épithéliales, des kératocytes et des cellules endothéliales, ainsi que les fibres d’élastines du trabéculum. La GSH permet de visualiser les lamelles de collagène de la cornée et les mailles de collagène du trabéculum. La GTH provenant des membranes cytoplasmiques ou nucléaires fournit une images des cellules épithéliales, des kératocytes et des cellules endothéliales cornéennes ou trabéculaires.

Discussion : La résolution spatiale est excellente (sub-micrométrique), supérieure à celle de la tomographie par cohérence optique, et la profondeur de pénétration élevée, supérieure à celle de la microscopie confocale. L’absence d’effets photo-disruptifs autoriserait une application in vivo.

Conclusion : La microscopie non linéaire est une méthode d’imagerie nouvelle permettant de visualiser la microstructure de la cornée et du trabéculum, et potentiellement applicable in vivo.