Les intoxications par les champignons chez l’homme mettent souvent en jeu les espèces appartenant aux genres Amanita ou Galerina. Les toxines responsables sont les amatoxines, telles que l’α-amanitine, la β-amanitine ou des phallotoxines, comme la phalloïdine, retrouvée chez Amanita phalloides. Afin d’identifier ces intoxications par les champignons et d’en estimer l’ampleur, nous avons développé une méthode de dosage des amatoxines et de la phalloidine dans les urines en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (LC-HR-MS) par mesure de la masse exacte par technologie Orbitrap (Q Exactive^®, Thermo Fisher Scientific). Les urines de patients pour lesquels une intoxication par les champignons est suspectée (adressées par les centres antipoison) ont été analysées par notre méthode et comparées à une technique immunoenzymatique ELISA (Bühlmann)

L’extraction de l’échantillon urinaire surchargé par le flurazepam, l’étalon interne (EI), se fait en phase solide (SPE) sur des cartouches Bond Elut Agilent Certify (C18, 200mg, 3mL). La séparation chromatographique est réalisée sur une colonne C18 Accucore (100 × 2,1mm, 2,6μm) à l’aide d’un gradient constitué d’un mélange d’acétate d’ammonium 10mM et d’acétonitrile contenant 0,1 % d’acide formique. La séparation des composés est réalisée en 7 minutes avec des temps de rétention respectivement de 1,9 ; 1,7 ; 3,5 et 3,8 minutes pour l’α-amanitine, la β-amanitine, la phalloidine et l’EI. La détection se fait par mesure de la masse exacte des espèces protonnées, respectivement de 919,3614 ; 920,3455 ; 789,3257 et 388,1586 (précision de 5ppm) pour l’α-amanitine, la β-amanitine, la phalloidine et l’EI.

Les courbes de calibration ont été obtenues en surchargeant de l’urine par chacune des mycotoxines à des concentrations ayant une pertinence clinique allant de 1 à 100ng/mL. Les coefficients de corrélation des droites, r² étaient supérieurs à 0,99 pour chaque amatoxine et pour la phalloidine. Sur le plan analytique, les LODs étaient de 0,25 ; 0,5 et 0,25ng/mL et les LOQs de 0,5 ; 0,75 et 0,5ng/mL respectivement pour l’α-amanitine, la β-amanitine, la phalloidine. La méthode a été validée en termes de linéarité, de répétabilité, de reproductibilité et d’effet matrice. Les urines de 43 patients suspectés d’être intoxiqués par des champignons ont été analysées par LC-HR-MS et les résultats ont été comparés à ceux obtenus à l’aide d’une technique ELISA faisant apparaitre une corrélation entre ces deux méthodes avec toutefois une meilleure sensibilité et une meilleure spécificité de la méthode séparative (LC-HR-MS).

Notre méthode de dosage par LC-HR-MS présente de nombreux avantages par rapport à la technique immunoenzymatique, en effet, elle est plus spécifique, plus rapide, plus sensible et est particulièrement bien adaptée aux cas d’analyse toxicologique d’urgence dans le cadre d’intoxications par les champignons.