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Détection, identification et quantification des mutations BRAFV600 par une technique ultrasensible de ice-cold PCR dans les tumeurs et le plasma de patients atteints de mélanome - 24/11/14

Doi : 10.1016/j.annder.2014.09.033 
A. How-Kit a, C. Lebbé b, , A. Bousard a, A. Daunay a, N. Mazaleyrat a, C. Daviaud a, C. Pages b, M. Bagot b, S. Mourah c, J. Tost d
a Laboratory for Functional genomics, Fondation Jean-Dausset, CEPH, Paris, France 
b Dermatologie, hopital Saint-Louis, Paris, France 
c Pharmacologie, hopital Saint-Louis, Paris, France 
d Laboratory for Epigenetics, Centre national de génotypage, CEA-Institut de génomique, Evry, France 

Auteur correspondant.

Résumé

Introduction

Deux inhibiteurs de fort enrichissement de la mutation au cours d’une PCR où allèles mutants et sauvages subissent respectivement une amplification exponentielle et linéaire.

Matériel et méthodes

Deux lignées cellulaires dérivées de mélanome humain porteuses de différentes mutations hétérozygote BRAFV600 ont été utilisées pour la mise au point de cette méthodologie. Des analyses moléculaires ont été réalisées sur 18 échantillons tumoraux de mélanome congélés, 17 échantillons de mélanome conservés en paraffine et 17 échantillons de plasma de patients atteints de mélanome avancé. La technique de ice-cold PCR a été réalisée en utilisant un thermocycleur 96 puits en temps réel suivi d’un pyroséquençage, puis identification et quantification automatique de la mutation.

Résultats

Avec ce dosage, une large gamme de 25 pg à 25 ng d’ADN peut être utilisée sans aucune réduction de l’efficacité de l’enrichissement de mutation. Cette technique est ultrasensible car elle peut détecter jusqu’à 0,01 % d’allèles mutés dans un fond de type sauvage. Le test a été validé sur prélèvement congelés, conservés en paraffine, et sur du plasma de patients atteints de mélanome. Il a permis la détection, l’identification et la quantification de différents types de mutation du gène BRAF présents dans les échantillons qui apparaissaient sauvages en utilisant des techniques moins sensibles comme le pyroséquençage standard, la discrimination allélique ou le séquençage Sanger.

Discussion

Notre test a un niveau de sensibilité élevé proche de la digital PCR, il est facilement réalisable facilement en une étape.

Conclusion

Ce test de ice-cold PCR BRAFV600 est actuellement un outil de diagnostic moléculaire extrêmement puissant pour la détection ultrasensible et la quantification de mutations BRAFV600.

Le texte complet de cet article est disponible en PDF.

Mots clés : BRAF, Ice-cold PCR, Mélanome


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Vol 141 - N° 12S

P. S232 - décembre 2014 Retour au numéro
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  • Valeur pronostique de la mutation BRAFV600 dans le mélanome au stade III AJCC
  • P. Saiag, P. Aegerter, C. Lebbé, P. Wolkenstein, N. Dupin, V. Descamps, S. Aractingi, D. Bosset, Z. Helias, S. Mourah, J.-F. Emile, MelanCohort
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  • La quantité d’allèle BRAFV600 muté dans la tumeur prédit la réponse thérapeutique au vémurafénib
  • C. Lebbé, A. How-Kit, M. Battistella, A. Sadoux, M.-P. Podgorniak, I. Sidina, C. Pages, J. Roux, M. Bagot, R. Porcher, J. Tost, S. Mourah

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