Article

PDF
Access to the PDF text
Service d'aide à la décision clinique
Advertising


Free Article !

Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 21, N° 5  - mai 1998
p. 345
Doi : JFO-05-1998-21-5-0181-5512-101019-ART51
Mise au point d'un test diagnostique de la choroïdérémieˆ: le test de troncation des protéines (PTT).
 

L. BEAUFRERE(1, 2), A. GIRARDET(1), B. ARNAUD(2), M. CLAUSTRES(1), S. TUFFERY(1)(Montpellier)

(1)Laboratoire de Biochimie Génétique, CNRS ERS-155,Institut de Biologie, Boulevard Henri IV, F-34060 Montpellier.

(2)Service d'Ophtalmologie,CHU de Montpellier, France.

Tirés à part : à l'adresse ci-dessus.

31 décembre 1997.23 mars 1998.

Molecular diagnosis of choroideremia.

Purpose

The aim of this study was to define the RT-PCR-PTT parameters for CHM gene analysis and to evaluate its interest as a method for CHM mutation screening.

Methods

The entire CHM coding region was reversed-transcribed in three overlapping cDNA segments (RT-PCR) which were amplified and further analyzed by PTT after in vitro transcription/translation.

Results

This strategy enabled us to detect a truncated peptide in each of the 6 unrelated patients from southern France who were investigated. The mutation was further characterized by direct sequencing of the RT-PCR product.

Conclusion

In CHM gene, all conditions are present to make the RT-PCR-PTT strategy the method of choice for mutation screening. As a result of the simplified protocol described in this study, the families of the patients could benefit from accurate carrier-status assessment.

Choroideremia.Genetic counselling.Protein truncation test.

But

Le diagnostic de choroïdérémie, cliniquement aisé aux stades initiaux de la maladie, peut être délicat lorsque l'atrophie choriorétinienne est évoluée. Dans le cadre d'un conseil génétique, la fiabilité du diagnostic est fondamentale lorsqu'il s'agit de renseigner la famille sur la nature du handicap fonctionnel, l'évolution de la maladie et le risque de récurrence familiale. Nous avons déterminé, pour la choroïdérémie, les paramètres du test de troncation des protéines (PTT) appliqué à l'analyse des transcrits CHM, qui autorise un diagnostic moléculaire de cette affection cécitante.

Matériel et méthodes

L'ADNc du gène CHM issu d'une transcription réverse spécifique de l'ARN total extrait du sang périphérique, est amplifié au cours de deux étapes de PCR. Les produits de RT-PCR sont ensuite soumis à une transcription et une traduction in vitro. Les profils de migration électrophorétique des peptides obtenus chez les 6 patients de notre série ont été comparés à des témoins normaux.

Résultats

Nous avons détecté, dans chacun des cas, un peptide tronqué révélant la présence d'une mutation terminatrice, identifiée ultérieurement par séquençage du produit de RT-PCR (transcription réverse-réaction de polymérisation en chaîne) correspondant.

Conclusion

Le test de troncation protéique permet, dans la choroïdérémie, la localisation et l'identification ciblée des mutations troncatives délétères. Il ouvre la voie à un diagnostic moléculaire de la maladie dans les cas difficiles.

Choroïdérémie.Conseil génétique.Test de troncation protéique.

La choroïdérémie est une dégénérescence chorio-rétinienne héréditaire de transmission récessive liée à l'X. Sur le plan fonctionnel, elle se traduit par une hespéranopie et une restriction concentrique progressive du champ visuel. A un stade avancé, la rétine centrale étant affectée, une baisse de l'acuité visuelle apparaît qui aboutira à la cécité définitive vers la cinquième décade de vie. Cette symptomatologie fonctionnelle est largement partagée avec les rétinopathies pigmentaires, affections avec lesquelles la choroïdérémie est souvent confondue. Ophtalmoscopiquement cependant, certains traits appartiennent en propre à la choroïdérémie. On observe, aux stades initiaux, une atrophie chorio-rétinienne de la moyenne périphérie d'évolution centripète et centrifuge dont l'aboutissement est la persistance d'un ilôt chorio-rétinien périmaculaire à bords festonnés. Les remaniements pigmentaires de la moyenne périphérie ont un aspect pseudo-ostéoblastique mais ne s'accompagnent pas de diminution du calibre des vaisseaux rétiniens ni d'atrophie papillaire, comme cela est observé dans les rétinopathies pigmentaires (Fig.ˆ1).

Le gène de la choroïdérémie a été localisé sur le bras long du chromosome X, en Xq21.2 par analyse délétionnelle chez des hommes atteints présentant des phénotypes complexes [1, 2]. Le gène, de 150ˆkb, a été par la suite isolé par la stratégie du clonage positionnel. Le cDNA a été séquencé en 1994 [3]. Il comprend 15 exons et code pour une protéine de 653 acides aminés, REP-1 (Rab Escort Protein-1), correspondant au composant A de la géranylgéranyl transférase [4]. Les protéines Rab constituent un groupe de petites protéines jouant un rôle dans la régulation du transport vésiculaire intra-cellulaire. La protéine REP-1 escorte la protéine Rab en vue d'une prénylation réalisée par le composant catalytique ß de la géranylgéranyl transférase [5].

A l'exception de grandes délétions identifiées chez certains patients européens, les mutations ponctuelles (substitutions, insertions ou délétions de bases) constituent l'essentiel des défauts moléculaires identifiés à ce jour dans le gène CHM. Ces mutations sont caractérisées par une hétérogénéité allélique, mais ce sont exclusivement des mutations nulles, aboutissant à une protéine REP-1 non fonctionnelle. La seule mutation faux sens décrite à ce jour qui altère l'avant dernière base de l'exon 11 [6], agit en réalité comme une mutation d'épissage en raison de sa localisation dans la

Fig.ˆ1. ­ Ophtalmoscopie et angiographie d'un patient atteint de choroïdérémie. 1aˆ: Atrophie chorio-rétinienne périmaculaire majeure dessinant un reliquat postérieur à bords festonnésˆ; remaniements pigmentaires pseudo-ostéoblastiques de la moyenne périphérie non accompagnés d'atrophie papillaire ni de diminution du calibre des vaisseaux rétiniens.1bˆ: Angiographie fluorescéinique (tempsˆ: 3'40'') objectivant l'existence d'un effet fenêtre en regard du reliquat chorio-rétinien démontrant l'atteinte de l'épithélium pigmentaire dans cette région.

Fig.ˆ2. ­ Modélisation des réactions chevauchantes. Représentation de la séquence codante (cDNA) du gène CHM localisé sur le bras long du chromosome X (Xq21.2). La totalité de la séquence codante est amplifiée en trois fragments chevauchants (CHM I, CHM II, CHM III). Les amorces a et b (couple externe, 5' et 3' respectivement) sont utilisées pour la PCR1. Les amorces c et d (couple interne, 5' et 3' respectivement) sont utilisées pour la PCR2. Les amorces c portent en 5' une extension contenant le promoteur de la T7 RNA polymérase et un motif eucaryote d'initiation de la traduction de type 5'-ggatcctaatacgactcactataggaacagaccaccatg-3' nécessaires à la réalisation du test PTT [9].séquence consensus du site donneur d'épissage de l'intron 11. Elle induit la délétion de l'exon 11 lors de la maturation des transcrits provoquant une rupture du cadre de lecture et l'apparition d'un codon stop prématuré dans l'exon 12 (données personnelles non montrées).

Bien que présentant une sensibilité réduite (80ˆ%), les techniques classiques de criblage mutationnel telle que l'analyse de conformation simple brin (SSCA) ont été utilisées en priorité pour rechercher ces mutations en raison de leur simplicité de mise en oeuvre. Chaque patient étant porteur d'une mutation unique, cette approche impose néanmoins pour être efficace, d'analyser l'un après l'autre chacun des 15 exons du gène CHM.

Nous avons mis au point une nouvelle stratégie de détection des mutations REP-1, extrêmement performante et moins fastidieuse, basée sur l'analyse des transcrits CHM isolés des lymphocytes circulants. La totalité de la séquence codante est ainsi accessible sous une forme condensée (2ˆkb) et peut être amplifiée en seulement trois fragments par la technique de réverse-transcription ­ PCR (RT-PCR). Les fragments de RT-PCR ainsi obtenus sont ensuite soumis au test de troncation des protéines (PTT), capable de détecter spécifiquement et avec une excellente sensibilité toute mutation provoquant un arrêt prématuré de la synthèse protéique. La stratégie RT-PCR/PTT a été appliquée à l'étude des patients CHM du Sud de la France.

MATERIEL ET METHODES

Patients

Nous avons étudié six hommes atteints de choroïdérémie, non apparentés, originaires du Sud de la France, après avoir recueilli leur consentement à l'étude de leurs caractéristiques génétiques.

Analyse des transcrits

Extraction de l'ARN, synthèse de l'ADN complémentaire et amplification

L'ARN total extrait des lymphocytes du sang périphérique [7], a été soumis à une transcription réverse comme précédemment décrit [8]. Les amorces ont été déterminées de façon à obtenir l'amplification de la totalité de la séquence codante (nucléotide 1-2095) en trois réactions partiellement chevauchantes (CHM I, CHM II, CHM III) (Fig.ˆ2). Le produit de transcription réverse est ensuite amplifié au cours de deux PCR successives (PCR1 et PCR2). Pour la PCR2, des amorces internes sont utilisées (PCR nichée), dont l'une (amorce sens) a été modifiée pour le test PTT de façon à contenir en 5' la séquence du promoteur de la T7 polymérase et le codon d'initation de la traduction (ATG) [9].

Fig.ˆ3. ­ Principe du test de troncation protéique. Après extraction de l'ARN total des lymphocytes du sang périphérique, une transcription réverse spécifique est réalisée qui permet d'obtenir l'ADN complémentaire. Le produit de transcription réverse est soumis à deux étapes de PCR (PCR1 et PCR2)ˆ; la PCR2 est dite «ˆnichéeˆ» en raison de l'utilisation d'amorces internes dont l'une, l'amorce 5', contient le promoteur de la T7 RNA polymérase et un signal eucaryote d'initation de la traduction (amplification de l'ADN complémentaire). Les produits de PCR sont ensuite soumis à une réaction couplée de transcription-traduction in vitro à l'aide d'un lysat réticulocytaire, en présence de 35S-méthionine. Les peptides obtenus sont ensuite migrés dans un gel de SDS-polyacrylamide à 15ˆ% pour séparation électrophorétique puis révélés par autoradiographie. La présence d'un peptide tronqué chez le patient (P) par rapport au peptide de taille normale observé chez le témoin normal (N) atteste de l'existence d'une interruption de la traduction (ici transversion G ˆT supprimant le codon acide glutamique GAA au profit d'un codon stop TAA).

Test de troncation protéique (PTT) (Fig.ˆ3)

Une aliquote (2 l) du produit de la T7-PCR2 nichée est utilisée directement pour une transcription/traduction in vitro en présence de (35S)-méthionine (Fig.ˆ3). Le produit de translation est ensuite dénaturé, refroidi dans la glace et migré dans un gel de SDS-polyacrylamide à 15ˆ% (17ˆmA pendant une heure). Le gel, fixé puis séché, est autoradiographié 24 h à ˆ80oˆC. La présence d'une mutation troncative est indiquée par la mise en évidence d'une bande de plus bas poids moléculaire, en place de la bande attendue. Le produit de RT-PCR correspondant est alors séquencé à l'aide du kit Sequenase version 2 (Amersham) afin d'identifier la mutation. Les mutations délétères sont systématiquement confirmées par séquençage direct de l'exon contenant la mutation, amplifié à partir de l'ADN génomique du patient à l'aide d'amorces précédemment décrites [3].

RESULTATS

L'étude du gène CHM par la technique de RT-PCR/PTT a permis l'identification de la mutation délétère chez les six patients soumis à cette analyse [8] (et données non publiées).

Les trois segments chevauchants d'ADN complémentaire CHM I, CHM II, CHM III obtenus chez chacun des patients ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Aucune modification de taille de ces fragments comparés aux témoins normaux n'a été observée. Ce résultat préliminaire permet d'exclure la présence d'une mutation à un site d'épissage, dans la mesure où une telle mutation aurait généré un fragment de RT-PCR de taille anormale, consécutive à un saut d'exon ou à l'insertion d'une séquence intronique.

Les produits RT-PCR ont été ensuite directement soumis au test de troncation protéique (PTT). Si le fragment à analyser contient une mutation induisant un arrêt prématuré de la synthèse protéique, un peptide tronqué est produit au cours de l'étape de transcription-traduction in vitro, puis détecté lors de la migration en gel de polyacrylamide dénaturant, par comparaison avec des témoins normaux.

Un exemple de peptide tronqué détecté chez un de nos patients est montré dans la figure 3. L'arrêt de la synthèse protéique dans ce cas est consécutif à la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) dans l'un des exons du gène CHM de ce patient. Cette substitution modifie un codon (GAA) codant pour l'acide glutamique en codon stop (TAA), la synthèse protéique s'interrompt prématurément.

La détection d'un peptide tronqué impose de séquencer le produit de RT-PCR correspondant (Fig.ˆ4)afin d'identifier l'altération moléculaire (ici la substitution G ˆT) responsable de l'anomalie observé sur le gel PTT, et caractériser ainsi la mutation.

La taille des peptides tronqués obtenus permet généralement de localiser approximativement l'emplacement de la mutation dans le fragment analysé et de restreindre le séquençage à une région précise du cDNA.

DISCUSSION

Après localisation d'une première mutation par la technique classique d'analyse de conformation simple brin (SSCA) [10], nous avons préféré abandonner cette méthode de recherche aléatoire au profit d'une stratégie intégrant le caractère troncatif des mutations responsables de choroïdérémie. Le test de troncation protéique est donc apparu comme étant la méthode de choix pour rechercher les mutations troncatives du gène CHM. A la différence des techniques classiques de criblage mutationnel (analyse de conformation simple brin (SSCA), électrophorèse en gradient de gel dénaturant (DGGE), analyse des hétéroduplex (HA), à l'aide desquelles les mutations sont détectées au niveau de l'ADN génomique, le test de troncation protéique s'attache à analyser les produits polypeptidiques obtenus après transcription et traduction in vitro d'ADN complémentaire amplifié à partir des régions d'intérêt du gène étudié.

Son utilisation pour l'analyse des transcrits CHM issus des lymphocytes circulants ne nécessite que trois réactions (tailles d'environ 700ˆpb) pour cribler la totalité de la séquence codante.

Cette stratégie de RT-PCR/PTT a permis d'identifier la mutation causale chez les six patients analysés.

Fig.ˆ4. ­ Identification de la mutation par séquençage. Le séquençage direct du produit de RT-PCR permet de caractériser la mutation détectée par le test PTT chez le patient. Une substitution G ˆT est identifiée chez le patient par comparaison avec une séquence normale.

En accord avec la diversité de la distribution des défauts moléculaires du gène CHM rapportés dans la littérature [11], les mutations identifiées dans notre série sont, à l'exception d'une seule, uniques et réparties dans des exons différents du gène. En l'absence de mutations majoritaires et de points chauds mutationnels, nos données tendent à démontrer que la totalité de la séquence codante doit être explorée si l'on veut définir avec précision le spectre mutationnel de cette affection.

Parmi l'ensemble des techniques de détection des mutations, le test de troncation protéique (PTT) nous apparaît être une méthode fiable de détection mutationnelle dès lors que les mutations responsables de l'affection sont majoritairement troncatives ou a fortiori, comme dans la choroïdérémie, exclusivement troncatives. Sa simplicité, sa facilité de mise en oeuvre et son excellente sensibilité sont autant d'arguments factuels plaidant en faveur de la stratégie RT-PCR/PTT comme méthode élective du criblage mutationnel du gène CHM.

Par ailleurs, le PTT permet l'analyse de fragments de grande taille (1 à 1,5ˆkb). Il est donc particulièrement adapté à l'étude des transcrits après RT-PCR et constitue un outil majeur de la détection des mutations inconnues dans les grands gènes [12, 13]. Sa mise au point, pour le gène de la choroïdérémie, autorise un diagnostic moléculaire fiable de cette affection. Le diagnostic d'hétérozygotie pour la mutation délétère peut être réalisé par le PTT qui met alors en évidence une double population de peptides (peptides tronqués et non tronqués) chez les femmes conductrices, se traduisant sur le gel de polyacrylamide dénaturant par l'existence d'un double signal peptidique. Il est cependant plus aisé chez les femmes à risque de rechercher spécifiquement la mutation caractérisée chez l'individu atteint de la famille, en amplifiant sélectivement à partir de l'ADN génomique l'exon porteur de l'anomalie. Le produit d'amplification (PCR) ainsi obtenu est ensuite directement séquencé ou soumis à un test de digestion (si la mutation modifie un site de coupure par une enzyme de restriction) afin de rechercher la présence de la mutation.

Dans le gène CHM, toutes les conditions sont présentes pour faire de la stratégie RT-PCR/PTT la méthode de choix du criblage des mutations pathogènesˆ; la technique d'analyse de conformation simple brin autorisant, elle, l'étude des polymorphismes de ce gène [11, 14].



REFERENCE(S)

[1]CREMERS F.P.M., VAN DE POL T.J.R., VAN KERKHOFF L.P.M., WIERINGA B., ROPERS H.H. ­ Cloning of a gene that is rearranged in patients with choroideremia. Nature, 1990; 347:674-677.

[2]MERRY D.E., JÄNNE P.A., LANDERS J.E., LEWIS R.A., NUSSBAUM R.L. ­ Isolation of a candidate gene for choroideremia. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89:2135-2139.

[3] VAN BOKHOVEN H., VAN DEN HURK J.A.J.M., BOGERD L., PHILIPPE C., GILGENKRANTZ S., de JONG P., ROPERS H.H., CREMERS F.P.M. ­ Cloning and characterization of the human choroideremia gene. Hum Mol Genet, 1994; 3:1041-1046.

[4]ANDRES D.A., SEABRA M.C., BROWN M.S., ARMSTRONG S.A., SMELAND T.E., CREMERS F.P.M., GOLDSTEIN J.L. ­ cDNA cloning of component A of Rab geranylgeranyl transferase and demonstration of its role as a Rab escort protein. Cell, 1993; 73:1091-1099.

[5]SEABRA M.C., GOLDSTEIN J.L., SÜDHOF T.C., BROWN M.S. ­ Rab geranylgeranyl transferaseˆ: a multisubunit enzyme that prenylates GTP-binding proteins terminating in Cys-X-Cys or Cys-Cys. J Biol Chem, 1992; 267:14497-14503.

[6]DONNELLY P., MENET H., FOUANON C., HERBERT O., MOISAN J.P., LE ROUX M.G., PASCAL O. ­ Missense mutation in the choroideremia gene. Hum Mol Genet, 1994; 3:1017.

[7]CHOMCZYNSKI P., SACCHI N. ­ Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987; 162:156-159.

[8]BEAUFRERE L., TUFFERY S., HAMEL C., BAREIL C., ARNAUD B., DEMAILLE J., CLAUSTRES M. ­ The protein truncation test (PTT) as a method of detection for choroideremia mutations. Exp Eye Res, 1997; 65:849-854.

[9]ROEST P.A.M., ROBERTS R.G., SUGINO S., VAN OMNEN G.J.B., DEN DUNNEN J.T. ­ Protein Truncation Test (PTT) for rapid detection of translation-terminating mutations. Hum Mol Genet, 1993; 2:1719-1721.

[10]BEAUFRERE L., TUFFERY S., HAMEL C., ARNAUD B., DEMAILLE J., CLAUSTRES M. ­ A novel mutation (S558X) causing choroideremia. Hum Mutat, 1996; 8:395.

[11]VAN DEN HURK J.A.J.M., SCHWARTZ M, VAN BOKHOVEN H, VAN DE POL T.J.R., BOGERD L., PINCKERS A.J.L.G., BLEEKER-WAGEMAKERS E.M., PAWLOWITZKI I.H., RÜTHER K., ROPERS H.H., CREMERS F.P.M. ­ Molecular basis of choroideremia (CHM): Mutations involving the Rab escort protein-1 (REP-1) gene. Hum Mutat, 1997; 9:110-117.

[12]MAUGARD C., TUFFERY S., BEAUFRERE L., BAREIL C., CLAUSTRES M. ­ Le test de troncation des protéines: un outil pour la détection de mutations ponctuelles dans l'ADN. Med Sci, 1997 (sous presse).

[13]TUFFERY S., UWE L., ROBERTS R.G., COUBES C., DEMAILLE J., CLAUSTRES M. ­ Protein truncation test: analysis of two novel point mutations at the carboxy-terminus of the human dystrophin gene associated with mental retardation. Hum Mutat, 1995; 6:126-135.

[14]BEAUFRERE L., TUFFERY S., HAMEL C., BAREIL C., ARNAUD B., DEMAILLE J., CLAUSTRES M. ­ An exonic polymorphism (381A/G) in the choroideremia gene. Genetic Counseling, 1997; 8:223-225.


© 1998 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
EM-CONSULTE.COM is registrered at the CNIL, déclaration n° 1286925.
As per the Law relating to information storage and personal integrity, you have the right to oppose (art 26 of that law), access (art 34 of that law) and rectify (art 36 of that law) your personal data. You may thus request that your data, should it be inaccurate, incomplete, unclear, outdated, not be used or stored, be corrected, clarified, updated or deleted.
Personal information regarding our website's visitors, including their identity, is confidential.
The owners of this website hereby guarantee to respect the legal confidentiality conditions, applicable in France, and not to disclose this data to third parties.
Close
Article Outline
You can move this window by clicking on the headline
@@#110903@@