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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 22, N° 3  - juillet 1999
p. 339
Doi : JFO-04-1999-22-3-0181-5512-101019-ART9
Les inhibiteurs des CDK-cyclines dans les mélanocytes choroïdiens normaux ettransformésLes inhibiteurs des CDK-cyclines dans les mélanocytes choroïdiens normaux ettransformés
 
COMMUNICATION DE LA SFO



JFO
1999; 22: 339-346
© Masson, Paris, 1999

F. Mouriaux(1), , C.A. Maurage(2), , P. Labalette(1), ,F. Casagrande(3), , F. Malecaze(3), , J.M. Darbon(3)
(1)Service d'ophtalmologie, Hôpital Claude Huriez, CHRU Lille 59037.
(2)Service d'anatomie-pathologique, Hôpital Calmette, CHRU Lille 59037.
(3)CJF INSERM 95-10, Pavillon Rayer, Hôpital Purpan, Toulouse 31059.

SUMMARY

Cyclin-dependent-kinases inhibitory proteins in normal and transformed choroidalmelanocytes

F.Mouriaux, C.A.Maurage, P.Labalette, F.Casagrande, F.Malecaze, J.M.Darbon

Purpose

Recent studies have demonstrated the close link between oncogenesis and cell cyclemachinery. Cyclin dependent kinase inhibitory proteins (Ckis) have been shown to beimplicated in cancer progression. We investigated the levels of the different regulatoryinhibitory proteins involved in the G1 progression and G1/S in choroidal melanomas.

Methods

Immunoblotting, immunoprecipitation and immunohistochemistry were performed on humanchoroidal cell lines and human choroïdal tumors.

Results

Our findings suggested a lack of expression of Cdk inhibitor p21 in two of threemelanoma cell lines and a striking underexpression of p27 in the three transformedcell lines. The p16 level was found to be almost the same in both normal and transformedcells, a loss of p16-Cdk4 interaction was observed in two of the three melanoma celllines. In immunohistochemistry, nuclear positivity for p16 was observed in six tumors.Nuclear positivity for p21 was observed in five tumors. All of theses tumors had scleralinvasion (p = 0,003). Nuclear positivity for p27 was observed in only twotumors.

Conclusion

Our results demonstrate that immunoreactivity for p16, p21 and p27 could beimplicated in progression of melanoma tumors. More cases are required to further clarifythis issue.

Key words : Choroidal melanomas. , cyclin-dependent-kinases inhibitory proteins. , cellcycle.

RÉSUMÉ


Les inhibiteurs des CDK-cyclines dans les mélanocytes choroïdiens normaux ettransformés

Introduction

Le mélanome choroïdien est la tumeur maligne oculaire primitive la plus fréquentechez l'adulte. De récents travaux ont démontré des perturbations du cycle cellulairedans les processus de transformation néoplasique. Nous avons recherché des anomalies desprincipales protéines inhibitrices des cyclin-dependant kinases (Ckis) dans le mélanomechoroïdien.

Matériel et méthodes

Nous avons étudié en immunoblot, en immunoprécipitation et en immunohistochimie lestatut des trois principales Ckis p16, p21 et p27 sur des lignées cellulaires demélanomes choroïdiens et sur des pièces d'exérèse de mélanome choroïdien.

Résultats

L'expression de p21 semble absente dans deux des trois lignées de mélanomes et cellede p27 est fortement diminuée dans les trois lignées de mélanomes par rapport auxcultures de mélanocytes. L'expression de p16 est constante dans tous les typescellulaires, par contre l'interaction p16-Cdk4 est déficiente dans deux des troislignées de mélanomes par rapport aux cultures de mélanocytes. En immunohistochimie, uneimmunoréactivité de p21 est observée dans 5 cas ­ un envahissement scléral estprésent dans ces cinq cas (p = 0,003) ­, une immunoréactivité de p16 estobservée dans 6 cas, et une immunoréactivité de p27 est observée dans deux cas.

Conclusion

Nos résultats suggèrent que les dysrégulations des Ckis pourraient être impliquéesdans la transformation néoplasique des mélanocytes choroïdiens en mélanome.

Mots clés : Mélanome choroïdien. , inhibiteurs des Cdks. , cycle cellulaire.


INTRODUCTION

Le mélanome malin de la choroïde est la tumeur maligne oculaire la plus fréquente.Le temps de doublement de la tumeur diffère considérablement selon les études puisquela vitesse d'évolution est extrêmement variable d'un sujet à l'autre ou cours du tempschez un même sujet [1, 2]. Les mécanismesphysiopathologiques conduisant à la transformation des mélanocytes ou des naevocytes encellules malignes sont mal connus. Depuis quelques années, de nombreux travaux surd'autres types cellulaires ont montré d'étroits liens entre les perturbations du cyclecellulaire et l'oncogénèse [3,4, 5, 6]. Il nous a semblé opportun defocaliser nos travaux sur le cycle cellulaire.

Au cSur de la régulation du cycle cellulaire se trouve une famille deSerine/Thréonine kinases, les Cdks (« cyclin dependent kinases »), et unensemble de protéines activatrices ou inhibitrices de leur fonction [7]. Les Cdks sont en fait lessous-unités catalytiques de complexes hétérodimériques formés avec les sous-unitésrégulatrices nécessaires à leur activation, les cyclines, dont l'expression estpériodique au cours du cycle cellulaire [8, 9]. À ce jour, 8 Cdks (cdks1à 8) et 11 cyclines (A, B1-3, C, D1-3, E, F, G) ont été mises en évidence et leurgène a été cloné. Cependant, le rôle et le niveau d'intervention précis dans lecycle cellulaire des différents complexes Cdk-cyclines dénombrés n'ont pu êtredéterminés que pour certains d'entre eux. Ainsi et par exemple, Cdk1 (aussi appelécdc2) s'associe avec les cyclines A et B pour former des complexes actifs au niveaude la transition G2/M. Cdk2 s'associe à la cycline E en phase G1 et à lacycline A en phase S. Cdk4 et Cdk6 se lient aux cyclines D durant la phaseG1 [10] (figure 1).

L'activité de ces complexes Cdk-cyclines peut être inhibée, soit par laphosphorylation de deux acides aminés ­ Thr14 et Tyr15 de la sous-unitécatalytique ­, soit par liaison à des protéines inhibitrices, les Ckis (« cyclindependent kinase inhibitor ») [11]. Ces inhibiteurs paraissentjouer des rôles essentiels dans le contrôle du cycle et de la croissance cellulaire.Leur dysfonctionnement pourrait rendre compte de processus de prolifération pathologiquecomme la prolifération tumorale. Deux familles d'inhibiteurs ont été identifiées selonleur homologie et leur spécificité d'interaction avec les complexes Cdk-cyclines. Lapremière famille comprend les protéines p21, p27 et p57. La seconde inclut lesprotéines p16, p15, p18 et p19 [12](figure 2).

Des dérégulations de l'expression des cyclines ont été fréquemment observées dansla prolifération néoplasique. En revanche, des désordres similaires des Cdks ontrarement été rapportés. Pourtant, l'activité des ces complexes Cdk-cyclines estévidemment perturbée par la perte ou le dysfonctionnement des Ckis précédemmentcitées. En effet, le gène codant pour la protéine p16 a été localisé sur la régionp21 du chromosome 9, région trouvée très souvent remaniée dans de nombreuseslignées cellulaires tumorales et tumeurs primitives [5, 6, 7]. Les remaniements observés ontconduit à considérer p16 comme un gène suppresseur de tumeur. Par contre, lesmutations de p21 et p27 sont exceptionnelles [3, 13]. Cependant, il semble quep21 soit quand même impliquée dans certains cancers de la prostate, de la peau etdans certaines tumeurs cérébrales [14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]. De même, le rôle de p27dans l'oncogénèse est admis : on a pu montré que l'absence de p27 était unmarqueur de mauvais pronostic dans les cancers colo-rectaux, mammaires et pulmonaires [21, 22]. En ophtalmologie, desdérégulations des cyclines D et E ont été observées [23]. Des mutations de p16 sontexceptionnelles même dans des familles atteintes de mélanome choroïdien [24, 25].

MATÉRIELS

Cultures cellulaires
Lignées de mélanomes choroïdiens

Ces lignées ont été établies à partir d'yeux énuclées pour mélanomechoroïdien. Ces lignées nous ont été aimablement fournies par le Dr Saornil del'institut Valladolid en Espagne : lignées SP6.5 (SP) de type mixte, OCM-1 (OCM) detype fusiforme et MKT-BR (MKT) de type épithélioïde. Les cellules ont été cultivéesdans le milieu de culture RPMI supplémenté en antibiotiques, antifongiques et avec5 % de sérum de veau fStal (SVF).

Cultures de mélanocytes choroïdiens

Ces cultures ont été établies selon la technique décrite par initialement par Hu etidentifiées par différentes techniques [26, 27]. Les cellules ont étécultivées dans le milieu de culture Ham's F12 supplémenté en antibiotiques,antifongiques, 5 ng/ml de bFGF, 0.1 nM d'isobutylméthylxanthine, 10 ng/mlde toxine cholérique et 10 % de SVF. Trois cultures provenant de trois patientsdifférents ont été utilisées dans cette étude.

Patients

Nous avons étudié 14 tumeurs provenant de 14 patients différents. Ils'agissait de 12 yeux énuclées pour mélanome choroïdien (tumeurs no 1à 12), d'une pièce d'exérèse d'un mélanome irien avec extension au corps ciliaire(tumeur no 13), et d'un fragment biopsique d'un mélanome choroïdienétendu à l'orbite (tumeur no 14). Il s'agissait de 8 hommes et6 femmes. L'âge moyen était de 66,6 ans (écart type : 11,3 ans). Lecôté droit était concerné dans 9 cas et le gauche dans 5 cas. Une seuletumeur avait été traitée avant l'énucléation, par prontothérapie (tumeur no 9).

Étude histologique

L'étude histologique a été effectuée en coloration usuelle. Le diagnostic demélanome était porté en microscopie photonique et mise en évidence enimmunohistochimie de la protéine S100 et de l'antigène HMB45. La tumeur était classéeen fusiforme, épithélioïde ou mixte selon la classification de Callender. L'indexmitotique (nombre de cellules en mitose par 0,3 mm2 sur 10 champssuccessifs x 400), la taille tumorale (diamètre le plus important et épaisseur),l'extension à la papille ont été reportés pour chaque tumeur. Une invasion scléralede plus de 10 % de l'épaisseur sclérale a été considérée comme significative (tableau I).

MÉTHODES

Immunoblot

Les cellules cultivées en monocouche ont été rincées par du PBS à températureambiante. Lorsqu'elles étaient à subconfluence, 250 μl de tampon de lyseLaemmli ont été ajoutés. Le taux de protéines de chaque population cellulaire a étédéterminée par la méthode de Bradford après extraction des protéines par 0,1 Mde NaOH. Les volumes d'extraits cellulaires déposés sur gel de SDS-polyacrylamidecontenaient 30 μg de protéines. Après électrophorèse, les protéines ontété transférées sur une membrane de nitrocellulose. Afin de bloquer les sites nonspécifiques, la membrane a été incubée toute la nuit dans du tampon Tris-NaClcontenant 0,05 % de tween (TBST), 5 % de lait et 1 % de serumalbuminebovine. Elle a ensuite été lavée puis mise en présence de l'anticorps primaire (p16,p21 et p27 de Santa Cruz à la dilution de 1 : 200) pendant 1 heure. Aprèsrinçage, la membrane a été incubée avec l'anticorps secondaire couplé à lapéroxydase. La révélation a été faite par autoradiographie (Technique ECL).

En ce qui concerne les immunoprécipitations, les cellules ont été lysées parsonication dans du tampon RIPA. Le lysât a ensuite été centrifugé à 4o Cpendant 5 min. Les complexes p16-Cdk4 ont été précipités en utilisant des billesde protéine A-Sépharose CL-4B pré-liées avec l'anticorps anti-Cdk4 (1/50). Les immunscomplexes ont enfin été chauffés dans le tampon de lyse Laemmli.

Immunohistochimie

L'étude immunohistochimique a été menée sur matériel inclus en paraffine. Leslames ont d'abord été chauffées au four à micro-onde pendant 3 min puisdéparaffinées dans du toluène pendant 15 min, rehydratées par des bainssuccessifs d'alcool à concentration décroissante et enfin lavées à l'eau courantependant 5 min. La peroxydase endogène a été bloquée par application d'eauoxygénée à 3 % diluée dans du méthanol pendant 30 min, à températureambiante. Afin de minimiser le bruit de fond, les lames ont été incubées avec du sérumde lapin dilué au 1/5 ème pendant 20 minutes. Les lames ont été incubéesavec l'anticorps primaire pendant une nuit (p16 Oncogene Res 1/25 ;p21 Oncogene Res 1/10 ; p27 Pharmingen 1/25 ; p53 Novocastra1/100 ; Mib-1 Immunotech 1/50). Après lavage au tampon phosphate-salinealbuminé (TPS), les lames ont été incubées en présence de l'anticorps secondairebiotinylé lapin anti-souris dilué au 1/200 pendant 30 min (Dakopatts,Copenhague). Les lames ont ensuite été rincées par du TPS albuminé, puis traitéespendant 30 min par une solution contenant de la péroxydase couplée à lastreptavidine. La révelation a été effectuée par le 3.3'-diaminobenzidinetétrahydrochloride (DAB) contenant de l'eau oxygénée. Les lames ont ensuite étérincées à l'eau courante puis colorées par de l'hématoxyline de Mayer diluée au ½dans de l'eau distillée pendant 1 min 30 secondes.

Des témoins positifs externes ont été établis. Nous avons également vérifié laprésence de témoins positifs internes (immunoréactivité des protéines dans les tissusadjacents). Des témoins négatifs (omission de l'anticorps primaire) ont étésystématiquement effectués.

Les cellules étaient considérées comme positives quand le noyau était distinctementcoloré par le DAB. Le pourcentage de noyaux positifs a été effectué par le mêmeopérateur (Dr CA Maurage) pour chaque anticorps, sur plusieurs champs (x 400)non contigus de façon à échantillonner la tumeur. La moyenne a été calculée etreportée. Un pourcentage de positivité nul ou de quelques rares cellules éparses étaitconsidéré comme non significatif et classé < 1 %.

Statistiques

Dans la base de donnée statistique, les inhibiteurs des Cdks ont été évalués demanière qualitative : positif si le pourcentage était supérieur ou égal à1 % et négatif dans le cas contraire. L'index mitotique et l'expression de Ki-67 ontété évalués de manière quantitative. La taille tumorale a été évaluée par leproduit de la longueur la plus importante et de l'épaisseur. Nous avons utilisé le testde Fisher exact, le &chi;2, le test de Wilcoxon et le coefficient decorrélation de Pearson.

RÉSULTATS

Comme le montre la figure 3,l'étude en Western Blot objective une altération de l'expression de deux inhibiteurs desCdk-cyclines dans les cellules transformées par rapport aux cellules normales : p27est fortement diminuée dans les trois lignées de mélanomes et p21 sembleindétectable dans deux de ces trois lignées. Par contre les taux de p16 ne varientpas quelque soit le type cellulaire. L'immunoprécipitation (figure 4), montre unealtération de l'intération p16-Cdk4 dans deux des lignées de mélanome (lignées MKT etSP).

En immunohistochimie, le pourcentage de positivité des noyaux vis à vis des anticorpsanti p16, p21 et p27 a varié selon la tumeur et l'anticorps (figure 5ettableau II). Nous avonsrecherché une corrélation entre ces inhibiteurs et les principaux facteurs histologiquespronostics des mélanomes malins. Une immunoréactivité de p16 a été détectée dans6 cas sans corrélation avec le type histologique, la taille tumorale, l'indexmitotique ou l'infiltration sclérale. Une immunoréactivité de p21 a été observéedans 5 cas sans corrélation avec le type histologique, la taille tumorale, l'indexmitotique. Par contre, toutes ces tumeurs exprimant p21 avaient un envahissement scléral(p = 0,003). Cependant le pourcentage de positivité n'était pas proportionnelà l'importance de l'envahissement. Une immunoréactivité de p27 a été détectée dansdeux prélèvements : il s'agissait de la seule tumeur traitée par protonthérapie(70 % de positivité) et la tumeur irienne (17 % de positivité). Uneimmunoréactivité de p53 a été observée à des taux très faibles dans deux cas (2,5et 4 %). Une immunoréactivité de Mib-1 (Ki67) a été détectée dans 13 cas.Nous avons mis en évidence une corrélation positive entre Mib-1 et l'index mitotique(p = 0,02), le pourcentage d'expression de Mib-1 étant plus élevé lorsquel'index mitotique était élevé. Nous avons également mis en évidence une corrélationinverse entre p27 et Mib-1, le pourcentage d'expression de Mib-1 étant plus élevélorsque p27 n'était pas détectée (p = 0,03).

DISCUSSION

De façon surprenante, nous avons mis en évidence une réduction de l'expression dep27 dans les lignées de mélanomes par rapport aux cultures cellulaires de mélanocyteset par rapport aux cultures « témoins ». Kato et coll. ont démontréque le taux de p27 était induit par un traitement par l'AMPc dans des macrophages [28]. Afin de nous affranchir d'untel effet, nous avons enlevé la toxine cholérique et l'IBMX 48 h avant le recueildes cellules. Nos résultats ne semblent donc pas être un artefact secondaire auxconditions de cultures et suggèrent donc que ce déficit en inhibiteur pourrait êtreimpliqué dans la transformation néoplasique du mélanome choroïdien. À l'instar de cerésultat, il a été montré en immunohistochimie une importante positivité de p27 dansdes tissus thyroïdiens et parathyroïdiens normaux par rapport à du tissu néoplasiquede même origine [29]. Dansnotre étude immunohistochimique, nous avons observé une forte immunoréactivité de p27dans le cas du mélanome traité par protonthérapie et dans le cas du mélanome irien.Actuellement, la physiopathologie de l'arrêt de la croissance tumorale ou de sarégression après protonthérapie est inconnue ; il nous semble possible quel'activation de p27 induirait un arrêt de la prolifération cellulaire et serait donc undes mécanisme de l'arrêt de la croissance du mélanome choroïdien. Le pronostic vitaldes tumeurs mélaniques de l'iris est lié de façon assez précise à leur aspectcytologique. On sait ainsi qu'à la cellule fusiforme correspond un pronostic favorablecar les décès sont très rares et une exérèse incomplète ne justifie pas ipso factol'énucléation [30]. Laprésence de p27 dans notre mélanome irien de type fusiforme pourrait ainsi expliquercette moindre agressivité tumorale. Cette hypothèse est confortée par nos résultatsavec le marqueur de prolifération Ki67. Nous avons noté une absence ou des taux trèsfaibles de Ki67 dans les tumeurs p27 positives, avec une corrélation statistiqueinverse (cependant, la significativité doit être interprétée avec réserve devant lefaible nombre de cas). De même, dans le cancer thyroïdien il a été démontré unecorrélation inverse entre p27 et Ki67 : le pourcentage de positivité étaitd'autant plus élevé que le pourcentage de Ckis était bas [29]. Ces résultats soulignentl'effet inhibiteur de p27 sur la progression du cycle cellulaire.

Nous avons observé une disparition de p21 dans deux des trois lignées de mélanomes.Cependant dans ces deux cas, une protéine de mobilité électrophorétique plus élevéeest observée ; on ne peut exclure à l'heure actuelle qu'il s'agisse d'une forme dep21 phosphorylée [31].Sur des cultures cellulaires et sur des tumeurs solides, il a été montré dans denombreux types cellulaires, une relation entre l'expression du gène de p21 et le degréde malignité [32, 33] Dans le mélanome cutané,p21 est corrélé à l'épaisseur des mélanomes superficiels, le nombre de cellulespositives étant statistiquement plus important dans les mélanomes plus épais [14]. Dans notre étude, nousavons observé une présence de p21 dans 5 des 6 tumeurs infiltrant ou dépassant lasclère (p = 0,003) à des taux variant entre 3 et 14 %. Bien que cespourcentages soient peu élevés, ils gardent leur significativité. En effet, dans lesadénocarcinomes pulmonaires, il a été montré que les pourcentages de positivité àp21 s'échelonnaient entre 5,4 et 13,8 % [34]. D'autre part, un pourcentagede p21 supérieur à 10 % serait hautement positif par référence à descellules normales sur différents types cellulaires [33].

A l'inverse de p21 et p27, nous n'avons pas observé de variation de l'expression dep16 dans les lignées de mélanomes par rapport aux cultures de mélanocytes. En fait, ilest raisonnable de postuler que c'est l'interaction p16-Cdk4 qui est affectée dans lescellules malignes comme l'ont montré d'autres auteurs [35]. En immunohistochimie et dansle tissu pigmenté cutané, le premier travail a montré que p16 était détectéedans 4/19 mélanomes cutanés et dans 17/28 naevus cutanés bénins [36]. De même, dans un autretravail complémentaire, p16 était détectée dans 46/79 mélanomes cutanés etdans 10/10 naevus. Le degré d'invasivité selon l'indice de Clark étaitstatistiquement plus élevé dans les tumeurs p16 négatives que dans les tumeursp16 positives [37]. Defaçon très intéressante, et à propos de 103 lésions pigmentées cutanées, il aété montré que p16 était exprimée dans 58 % des mélanomes cutanés, danstous les naevus atypiques et mélanomes in situ. Cependant, son expression diminuait defaçon significative dans les mélanomes invasifs et métastatiques suggérant que laperte de l'expressivité de p16 serait liée à l'agressivité et à la capacité àmétastasier [38]. Dans notreétude, nous retrouvons une expression de p16 dans 43 % des mélanomes sanscorrélation avec le type histologique, la taille tumorale, l'index mitotique oul'infiltration sclérale. Cependant les énucléations que nous avons été amenés àpratiquer étaient motivées dans la majorité des cas par des tumeurs de grandes tailles.Il ne nous a donc pas été possible d'étudier et surtout de comparer assez de tumeursd'épaisseur inférieure à 10 mm et ainsi d'analyser leur immunoréactivitévis-à-vis des anticorps anti-Ckis. De plus et à l'inverse du tissu cutané, nous nedisposions pas de naevus choroïdien afin de comparer l'immunoréactivité entre la tumeurmaligne et sa contrepartie non transformée.

 

 

2

(Les tableaux sont exclusivement disponibles en format PDF).

 


(Les tableaux sont exclusivement disponibles en format PDF).

 

Figure 1. Régulation du cycle cellulaire par les complexes cdk-cyclines (conceptionJ.M. Darbon). L'épaisseur des flèches symbolise l'expression quantitative descyclines et la formation ordonnée dans le temps des différents complexes cdk-cyclines. Rreprésente le point de restriction à partir duquel la progression des cellules en G1 estindépendante des facteurs de croissance.

 

Figure 2. Action inhibitrices des Ckis sur les complexes cdk-cyclines. Sites potentielsd'action des inhibiteurs des complexes Cdk-cyclines p15, p16, p21 et p27 sur la phase G1et la transition G1/S du cycle cellulaire.

 

Figure 3. Western Blot : Expression protéique des Ckis dans les mélanocyteschoroïdiens normaux et transformés. Nous avons étudié l'expression de p21, p27 et p16dans 3 lignées cellulaires de mélanome choroïdien (Sp, OCM, MKT) et dans3 cultures cellulaires de mélanocytes choroïdiens normaux (TCM5-6 et 8). À titrede contrôle, nous avons utilisé des cellules épithéliales pigmentaires de la rétine(RPE) et des fibroblastes choroïdiens (FIBRO).

 

Figure 4. Immunoprécipitation : Étude de l'interaction p16-cdk4 dans lesmélanocytes choroïdiens normaux et transformés. Nous avons étudié l'expression del'interaction p16-cdk4 dans 3 lignées cellulaires de mélanome choroïdien (Sp, OCM,MKT) et dans 3 cultures cellulaires de mélanocytes choroïdiens normaux (TCM5-6 et8).

 

Figure 5. Photographie de l'immunoréactivité des Ckis dans le mélanome choroïdien.Les noyaux immunoréactifs (positifs) sont marqués en marron par le DAB. a. photographiede l'immunoréactivité de p16 dans la tumeur no 7 (x 1000). b.photographie de l'immunoréactivité de p21 dans la tumeur no 7(x 1000). c. photographie de l'immunoréactivité de p27 dans la tumeur no 11(x 1000). d. photographie de l'immunoréactivité de Mib-1 (Ki67) dans la tumeur no 13(x 400) (x 200).



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