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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 22, N° 9  - octobre 1999
p. 1003
Doi : JFO-09-1999-22-9-0181-5512-101019-ART14
REVUE GÉNÉRALE

Propriétés de fluorescence et particularités métaboliques du vert d'indocyanine(ICG)
 

REVUE GÉNÉRALE

Journal Français d'Ophtalmologie1999; 22: 1003
© Masson, Paris, 1999

T. Desmettre(1)(2), J.M. Devoisselle(3), , S. Soulie-Begu(3), , S. Mordon(1)

(1)INSERM-EA 2689-IFR 22, Pavillon Vancostenobel, CHU, 59037 Lille, France.
(2)Centre d'Imagerie & de Laser, 59130 Lambersart, France.
(3)Laboratoire de Technique Pharmaceutique Industrielle, UFR des sciencespharmaceutiques, 34060 Montpellier Cedex 01.

  • INTRODUCTION
  • BASICS
  • The use of fluorescence for imaging
  • Indocyanine green
  • Pharmacokinetics and in vivo behaviour
  • Advances of the use of ICG in ophthalmology
  • Spectra
  • ICG-enhanced photocoagulation
  • Yield of fluorescence
    • Scattering of the fluorescence light
    • Quenching: role of ICG concentration
    • Scattering and absorption of the fluorescence light
    • Diffusion of the ICG molecules
  • CLINICAL OUTCOME
  • Influence of ICG features on ophthalmologic images
    • The infrared spectrum images
    • ICG concentration decay
    • Drusen staining
    • Neovascular membranes staining
    • Variations of the fluorescence yield
    • SLO or fundus camera
    • ICG angiography and inflammatory diseases
  • ICG and Sodium fluorescein
  • CONCLUSION

Key words : Fluorescence. , ICG. , indocyanine green.

  • INTRODUCTION
  • ASPECTS FONDAMENTAUX
    • L'utilisation de la fluorescence pour la réalisation d'images
    • Le vert d'indocyanine
    • Aspects pharmacocinétiques, et comportement in vivo de la molécule
    • Historique de l'utilisation de l'ICG en ophtalmologie
    • Caractéristiques spectrales de l'ICG
    • La photocoagulation renforcée par ICG
    • Le rendement de fluorescence de l'ICG
      • Le mode de diffusion optique de la lumière de fluorescence
      • Le quenching : le rôle de la concentration d'ICG
      • L'effet de dispersion et d'absorption de la fluorescence
      • La diffusion des molécules d'ICG
  • ASPECTS CLINIQUES
    • Influence des particularités de l'ICG sur la sémiologie ophtalmologique
      • L'imagerie dans le spectre infrarouge
      • L'élimination progressive du colorant
      • L'imprégnation des drusen
      • L'imprégnation des néovaisseaux de la DMLA
      • Les variations du rendement de fluorescence du colorant
      • SLO ou rétinographe ?
      • Angiographie ICG et pathologies inflammatoires
    • Vert d'indocyanine et fluorescéine sodique
  • CONCLUSION

Mots clés : Fluorescence. , ICG. , vert d'Indocyanine.


INTRODUCTION

Le vert d'indocyanine (ICG) est un colorant fluorescent utilisé pour la réalisationd'imagerie de la vascularisation rétinienne et choroïdienne depuis plus de 20 ans [1, 2]. Le haut poids moléculaire(775 dalton), les particularités métaboliques (confinement intra vasculaire favorisépar la fixation aux protéines ou lipoprotéines plasmatiques, excrétion rapide par voiebiliaire exclusive), et enfin les spectres d'absorption et d'émission, font laspécificité des images en fluorescence utilisant ce colorant [3]. L'utilisation de l'imagerienumérique statique ou dynamique a permis récemment d'utiliser des images de hautedéfinition pour établir une sémiologie spécifique lors des angiographieschoroïdiennes et rétiniennes en lumière infrarouge [2, 4, 5, 6, 7, 8]. L'intérêt de cettesémiologie qui permet parfois de modifier une décision thérapeutique a provoqué à sontour un regain d'intérêt pour la compréhension des images et des mécanismes de lafluorescence de l'ICG aux différents temps de l'angiographie.

La vascularisation choroïdienne est responsable des apports de métabolites etd'oxygène pour les deux tiers externes de l'épaisseur rétinienne sauf au niveau de larégion fovéolaire où elle apporte la totalité des nutriments et de l'oxygène.Paradoxalement ce système de vascularisation et son rôle en pathologie est peu connu. Laprésence de la couche unicellulaire de l'épithélium pigmentaire, relativement opaque àla lumière visible et donc responsable d'un « effet masque » physiologiquelors des photographies du fond d'œil et des angiographies à la fluorescéineexplique en grande partie cette relative méconnaissance. Parce qu'elle permet de mettreen évidence la vascularisation choroïdienne, l'angiographie au vert d'indocyanine estd'un apport incontournable en ophtalmologie. Néanmoins l'interprétation des images restesouvent difficile. Le but de cette mise au point est de reprendre l'état actuel desconnaissances sur le métabolisme et la fluorescence du vert d'indocyanine pour lesresituer dans le contexte de l'imagerie ophtalmologique.

ASPECTS FONDAMENTAUX

L'utilisation de la fluorescence pour la réalisation d'images

Tout atome ou toute molécule peut se présenter sous différents niveaux d'énergieélectronique. Dans son état fondamental, la molécule (ou l'atome) présente uneénergie minimale. L'absorption de lumière va la porter à des niveaux d'énergiesupérieure. Le retour à l'état fondamental peut se faire par l'émission delumière : la fluorescence. La fluorescence correspond donc à une émission delumière dont le rayonnement se produit par transition spontanée depuis un niveaud'énergie préalablement excité jusqu'au niveau fondamental. Suivant la règle deStokes, les longueurs d'onde émises par fluorescence sous l'action d'une lumièreexcitatrice de longueur d'onde &lgr;o sont généralement supérieures à &lgr;o.C'est le fait d'avoir une différence de longueur d'onde entre l'excitation et l'émissionqui permet d'exploiter le phénomène à l'aide de filtres interférentiels pour laréalisation d'images.

Le vert d'indocyanine

Le vert d'indocyanine est une molécule de 775 dalton. Sa structure moléculaire luiconfère des propriétés amphiphiles c'est à dire à la fois hydrophile et hydrophobe.En effet, cette molécule est constituée de l'assemblage de deux parties polycycliques(benzoindotricarbocyanine) relativement hydrophobes reliées entre elles par une chaînehydrocarbonée. La solubilité dans l'eau de ce composé est due à l'existence des deuxgroupements sulfates portés par chaque partie polycyclique au niveau du noyau indol (fig. 1) [9].

Le caractère amphiphile de la molécule explique sa forte affinité pour lesprotéines plasmatiques, en particulier envers les lipoprotéines. Son mode d'éliminationhépato-biliaire traduit bien la propriété lipophile de l'ICG.

Le vert d'indocyanine est présent dans différentes spécialités pharmaceutiques (tableau I) . La présenced'iode est due au mode de fabrication de la molécule, une purification intervenant à lafin de la fabrication pour éliminer de la façon la plus complète possible cesmolécules d'iode. La société Serb (France) a développé un mode de synthèse originalsans utilisation d'iode [10].Actuellement cette spécialité pharmaceutique dispose en France d'une ATU (autorisationtemporaire d'utilisation) réservée aux milieux hospitaliers. Une procédure AMM(autorisation de mise sur le marché) est en cours.

Aspects pharmacocinétiques, et comportement in vivo

Le mode d'élimination hépato-biliaire explique la rapidité de l'élimination ded'ICG après injection intraveineuse. Les premières publications sur le vertd'indocyanine faisaient état d'une demi vie de 2 à 4 minutes (fig. 2) [11, 12, 13, 14]. Ces éléments concordentavec les études plus récentes en spectrophotométrie sur la cinétique d'éliminationqui font état d'une décroissance exponentielle en deux phases : une première phaserapide permettant de calculer une demi vie entre 3 et 4 minutes et une deuxième phaselente permettant de calculer une demie-vie de l'ordre d'une heure (fig. 2) [13, 15, 16].

Comme on l'observe sur la figure 3, le modèle mono-exponentiel constitue une bonne approximation pour les temps précoces.Par contre, pour l'étude des temps tardifs (après 30 à 50 minutes) une modélisation del'élimination selon une décroissance bi-exponentielle semble indispensable. Le deuxièmeterme intervient de façon plus prépondérante aux temps tardifs (fig. 3) .

Il faut bien noter que les connaissances acquises sur la pharmacocinétique de l'ICGsont issues de travaux menés dans des applications très différentes. En effet, cettepharmacocinétique a été étudiée à la fois en explorations fonctionnelleshépatiques, en ophtalmologie et dans le domaine de la microvascularisation sous cutanée.Il apparaît alors que la diversité des modèles étudiés et des natures devascularisation (gros troncs, capillaires ou artérioles) permet d'aboutir à descinétiques qui ne sont pas strictement comparables [15, 16, 17, 18].

Historique de l'utilisation de l'ICG en ophtalmologie

Au tout début des années 1970 l'angiographie au vert d'indocyanine a été proposéepour l'ophtalmologie par Kogure et Choromokos qui avaient d'abord proposé la méthodepour l'analyse de débits sanguins cérébraux, puis par Hocheimer [19, 20]. La méthode utilisait lespropriétés d'absorption du colorant. Flower et Hocheimer réalisèrent une premièreétude chez 47 patients comportant la réalisation simultanée d'une angiographie à lafluorescéine et une d'angiographie ICG par absorption [21]. Cette étude permettait decomparer l'apport des deux colorants pour l'imagerie oculaire. Par la suite, Helsetine etFlower observèrent une faible fluorescence de l'ICG dans le domaine de l'infrarouge. Lespremières angiographies en fluorescence utilisant l'ICG furent réalisées chez l'hommepar Flower. Les premières études sur le quenching, l'amélioration du système defiltres et enfin l'utilisation de caméras intensifiées (caméras de haute sensibilitéou ultrasensibles) ont permis une certaine amélioration de la qualité des images quirestaient cependant bruitées et dont la résolution était faible.

La prise de clichés à grande vitesse puis l'utilisation de systèmes vidéos et enfinl'utilisation d'une excitation par diode laser ont progressivement permis une meilleurevisualisation des membranes néovasculaires choroïdiennes [4, 22]. Enfin, l'étape de lanumérisation a plus récemment permis de réaliser des images en haute définition.

Caractéristiques spectrales de l'ICG

Le spectre d'absorption de l'ICG dépend de la nature du solvant et de la concentrationdu colorant. En phase aqueuse, l'ICG a tendance à former des polymères et ceci d'autantplus que sa concentration est élevée. Ce phénomène se traduit par un changementprogressif des spectres d'absorption avec un aspect « en miroir » (fig. 4) [3, 8], et par une dégradationchimique plus rapide [8, 23]. En présence de protéines,l'ICG établit des liaisons avec ces protéines qui gênent la formation des polymères [8, 24, 25]. Immédiatement aprèsinjection intraveineuse, la liaison aux protéines plasmatiques provoque un déplacementde 25 nm du spectre d'absorption dont le pic passe de 780 à 805 nm [3, 13]. Ce déplacement du spectrecorrespond au changement de l'environnement physico-chimique de la molécule au cours despremières secondes après l'injection. Sur certains rétinographes, une adaptation defiltre correspondant à ce déplacement du spectre vise à optimiser le rendement defluorescence du colorant. L'interaction des 2 phénomènes - formation de polymères etfixation aux protéines ou aux lipoprotéines plasmatiques - explique en partie larelative stabilité du spectre d'absorption de l'ICG en solution plasmatique après ladilution initiale (fig. 4)et (fig. 5) .

En solution aqueuse, le pic d'émission de l'ICG est décrit à 820 nm (Benson) ou 810nm (Hollins) [1, 13]. Le pic d'émission de l'ICGen solution plasmatique est déplacé vers les plus grandes longueurs d'ondes, entre 820et 830 nm [1, 26]. De plus des étudesmontrent des variations de la position du pic d'émission de l'ICG plasmatique en fonctiondu délai après l'injection [27,28]. D'une manièregénérale, les propriétés de fluorescence de ce colorant (spectre et intensité defluorescence) varient en fonction de sa concentration et de son environnementphysico-chimique (notamment dans un liquide biologique). En effet, la fluorescence del'ICG varie en fonction de sa concentration dans le sang total : cette fluorescencecroît de façon linéaire jusqu'à une concentration de l'ordre de 80µg/ml pour diminuerensuite fortement (phénomène d'auto extinction de la fluorescence ou quenching) [1, 24, 26]. Lors d'une étude sur unmodèle animal, nous avons montré un décalage ou shift du pic de fluorescence de826 nm vers 835 nm augmentant avec le délai après injection [26, 27]. Ce shift concorderait aveccertains résultats obtenus chez l'homme [28]. Une modification del'environnement hydrophile/hydrophobe d'une certaine proportion de molécules d'ICG seraitcompatible avec un tel décalage du pic de fluorescence maximum.

Les différentes interactions de l'ICG avec son micro environnement (interactionscolorant-colorant, interaction ICG - protéine, lipoprotéines voire paroi vasculaire etenvironnement extra vasculaire) sont probablement responsables de ces modifications depropriétés de fluorescence. Très peu d'études ont été dédiées à cet aspect. Destravaux récents montrent cependant que l'ICG est capable d'interagir avec des systèmesdispersés tels que des micelles, des liposomes (modèles membranaires), et que sespropriétés spectrales en sont largement modifiées, à l'état fondamental et à l'étatexcité [29, 30, 31]. L'incubation de moléculesd'ICG avec de tels systèmes provoque un déplacement du pic de fluorescence maximum versles grandes longueurs d'onde et une augmentation du rendement de fluorescence. Cettemodification des propriétés de fluorescence témoigne de la possibilité pour lamolécule d'ICG d'interagir avec une structure phospholipidique [30, 31, 32]. De plus, Yoneya arécemment confirmé l'affinité de l'ICG pour des interfaces riches en phospholipides [33]. Il semble que la partiehydrophobe de l'ICG (parties polycycliques) soit capable de se fixer à l'interfacephospholipide-eau. Ainsi, une fixation d'ICG sur la paroi de l'endothélium vasculairepourrait expliquer le déplacement du pic de fluorescence [26].

La photocoagulation renforcée par ICG

Une autre spécificité de l'ICG est la relation entre le spectre d'absorption de lamolécule et la longueur d'onde d'émission des lasers à diodes actuellementcommercialisés [34, 35]. Cette spécificité a étéétudiée par plusieurs auteurs, en particulier pour une éventuelle application cliniqueutilisant l'ICG en temps que chromophore. Pour cette application la photocoagulation nedépend pas des caractéristiques d'absorption du tissu cible mais de la présence d'unchromophore absorbant la lumière laser au sein du tissu. Les applications pourraientconcerner les néovaisseaux sous rétiniens de la dégénérescence maculaire liée àl'âge (DMLA) [36, 37, 38, 39].

En particulier, l'étude de Reichel & Puliafito a évalué l'intérêt de latechnique sur 10 patients présentant des néovaisseaux occultes. Un seul patient sur les10 a présenté une baisse d'acuité visuelle après le traitement laser. L'acuité desautres patients est restée stable au cours du suivi moyen sur 15 mois, ce qui représenteun résultat positif par rapport à une évolution spontanée.

Cependant, la diffusion de l'ICG à partir des néovaisseaux et le caractère relatifde la fixation du colorant au niveau de ces vaisseaux rend difficile la sélectivité etla reproductibilité lors de cette application [40]. Surtout, la courte demi-vieplasmatique du chromophore est un inconvénient de la technique. Dans l'étude de Reichel& Puliafito la photocoagulation était réalisée entre 2 et 5 minutes aprèsl'injection d'ICG. La séance durait 2 à 3 minutes.

L'incorporation de l'ICG dans une émulsion pourrait permettre de prolonger lerenforcement de la photocoagulation induit par la présence de colorant en diminuant sonélimination hépatique [41, 42]. Cette technique requiertcependant un agrément pour une utilisation en clinique humaine. D'autres techniques ontété proposées en particulier pour des applications en dermatologie. Une injectioncontinue d'ICG visant à maintenir identique la concentration sanguine de chromophore aété proposée [43].Cependant, la diffusion d'ICG à partir des vaisseaux augmente avec la durée d'injection.Cette diffusion réduit alors l'intérêt de la technique puisqu'elle diminue lasélectivité des photocoagulations. Libutti a proposé le développement de ligandspermettant la fixation de molécules de colorant à l'intima des vaisseaux, augmentantainsi la concentration locale [44].La technique requiert également un agrément pour une utilisation chez l'homme. Une autretechnique proposée utilise une adaptation de la fluence du laser tout au cours de laséance de photocoagulation, permettant de compenser l'élimination de l'ICG [45].

Le rendement de fluorescence de l'ICG

Le rendement de fluorescence de l'ICG est environ 25 fois inférieur à celui de lafluorescéine [25]. Parcontre cette fluorescence a lieu dans le spectre infrarouge pour lequel seuls 10% de lalumière est absorbée par la mélanine de l'épithélium pigmentaire [46].

La notion du rendement de la fluorescence d'un fluorophore fait intervenir des notionscomplexes de diffusion, réflexion, transmission et absorption du rayonnement infrarougede la lumière excitatrice, mais aussi de la lumière de fluorescence sur les moléculestissulaires [47]. Ladiffusion du rayonnement infrarouge de la lumière excitatrice sur les moléculestissulaires dépend de la taille de ces molécules par rapport à la longueur d'onde durayonnement.

Le mode de diffusion optique de la lumière de fluorescence

D'une manière schématique la diffusion d'un rayonnement sur des particules de tailletrès inférieure à la longueur d'onde se fait suivant une diffusion optique de Raleighalors que la diffusion de ce rayonnement sur des particules de taille voisine de lalongueur d'onde se fait suivant une diffusion de Mie (« Forward Scattering »)[47]. Ces deux modes dediffusion sont schématisés sur la figure 6 , elles impliquentdes rendements de fluorescence différents. La proportion entre ces deux modes dediffusion s'inverse progressivement lorsqu'un rayonnement éclaire un milieu dont lataille des molécules augmente. En présence des petites molécules plasmatiques, ladiffusion de Raleigh prédomine, en présence des hématies la diffusion de Mie intervientde façon plus importante. La diffusion de Raleigh permet un rendement supérieur pour lafluorescence parce qu'elle est quasi isotropique alors que la diffusion de Mie,essentiellement dirigée vers l'avant, aboutit à un rendement plus faible peut êtreexpliqué par une absorption de photons sur les hématies [2, 48, 49] (fig. 6) . Une solutionplasmatique d'ICG est environ 6 fois plus fluorescente qu'une solution sanguine [46].

Le quenching : le rôle de la concentration d'ICG

Le quenching ou extinction de la fluorescence est observé pour des concentrationssanguines supérieures à 0.1 mg/ml (ou des concentrations plasmatiques supérieures à0.05mg/ml en raison de l'exclusion des globules rouges) [50]. Ce quenching est expliquépar la formation de dimères et polymères dans une proportion qui augmente avec laconcentration. Ces formes ont un rendement de fluorescence plus faible que l'ICG libre ouliée aux protéines et lipoprotéines plasmatiques (fig. 7) .

L'effet de dispersion et d'absorption de la fluorescence

Contrairement à ce qui se passe pour la fluorescéine, le rayonnement d'excitation etd'émission infrarouge n'est pas ou peu absorbé par l'hémoglobine. Cette« transparence » des structures contenant du sang pour le rayonnementd'émission de la fluorescence de l'ICG donne un caractère « additif » àl'émission de fluorescence provenant des différentes couches vasculaires. Sur la figure 9 on observe uneintensité de fluorescence plus importante au niveau des croisements des vaisseaux [49, 50].

La diffusion des molécules d'ICG

Les premières publications sur l'ICG faisaient état d'un confinement intravasculaireplus important que celui des molécules de fluorescéine. Ce confinement intravasculairepourrait être lié à des liaisons aux protéines plasmatiques telles que l'albumine oul'alpha1 lipoprotéine [24].Il est ensuite apparu que les molécules d'ICG pouvaient diffuser dans certainesconditions et que cette diffusion influençait la sémiologie angiographique infrarouge [40, 51, 52]. En particulier Ho asouligné l'inconvénient que pouvait représenter cette diffusion pour les applicationsde photocoagulation renforcée par ICG [40]. Plus récemment, Chang amontré avec des corrélations anatomo-histologiques qu'au cours de la séquenced'angiographie le colorant diffusait vers le stroma choroïdien puis s'accumulait au seinde l'épithélium pigmentaire rétinien et pouvait se lier au matériel lipidique desdrusen [53]. En particuliercet auteur note au temps précoce (7 minutes) la présence d'une fluorescence le long del'endothélium vasculaire, la membrane de Bruch et à un titre moins important au niveaudu stroma extravasculaire choroïdien. Quinze minutes après injection la fluorescence estretrouvée au sein de l'épithélium pigmentaire, de la membrane de Bruch et de drusen.Cinquante minutes après injection cette fluorescence est surtout retrouvée au niveau ducomplexe épithélium pigmentaire - membrane de Bruch et au niveau de drusen. L'auteurnote l'absence de fluorescence provenant de la rétine sensorielle ou de la sclère. Ilfaut noter que cette étude concerne à la fois des singes Maccaca mulata d'unetrentaine d'années présentant des drusen d'allure miliaire, et un œil humainénucléé pour le traitement d'un mélanome.

ASPECTS CLINIQUES

Influence des particularités physico-chimiques de l'ICG sur la sémiologie des imagesd'angiographie
L'imagerie dans le spectre infrarouge

Les conséquences de l'utilisation de cette partie du spectre sont nombreuses. Lavisibilité des couches rétiniennes et des couches choroïdiennes est le premierélément remarqué par l'observateur d'un cliché d'angiographie ICG. Cette lecture« comme dans un livre dont les pages seraient transparentes » selonl'expression de G. Quentel (communication personnelle) ne facilite pas l'interprétationdes images. La visibilité des couches profondes est en rapport avec la diffusiond'environ 90 % de la lumière infrarouge à travers l'épithélium pigmentaire (fig. 8) et (fig. 9) . Cette propriétéde diffusion particulière des photons infrarouges par rapport aux photons verts impliqueun autre phénomène qui est une perte d'information par perte de la cohérence de lalumière d'émission de fluorescence. Pour un champ qui est constant tel que la portion dufond d'œil observée à travers un rétinographe, la netteté d'un cliché en ICGapparaît plus faible qu'en lumière visible.

L'élimination progressive du colorant

Lors de la réalisation d'une angiographie au vert d'indocyanine, l'élimination rapidedu colorant nécessite d'augmenter le gain de la caméra pour obtenir des imagesexploitables. L'étude de l'intensité de fluorescence de l'ICG au cours du temps dépendà la fois de la pharmacocinétique du colorant, mais également des moyens d'étude, enparticulier du mode d'excitation de la fluorescence et de la sensibilité des caméras [51, 54].

Certains auteurs ont récemment utilisé un rétinographe Topcon® sur lequell'excitation est assurée par une diode à 780 nm pendant les 5 premières minutes puis à805 nm pendant la suite de l'examen. Des angiographies ICG ont été réalisées chez 10volontaires sains avec ce système. Selon les auteurs, la technique d'excitation permet demieux visualiser les structures choroïdiennes surtout aux temps tardifs [55]. On peut s'interroger sur lechoix du délai de 5 minutes pour le changement de la longueur d'onde d'excitation puisquela stabilisation spectrale de l'ICG dans le sang s'effectue en quelques secondes [3].

L'imprégnation des drusen

Les drusen rétiniens sont la conséquence d'une digestion incomplète desphotorécepteurs et, en particulier des débris des segments externes des bâtonnets parles cellules de l'épithélium pigmentaire [56]. Il existe de nombreusesclassifications des drusen suivant leur aspect biomicroscopique, leurs propriétés defluorescence lors des angiographies à la fluorescéine ou au vert d'indocyanine, ou leurscaractéristiques histochimiques. Certains auteurs ont décrit des drusen riches enlipides et d'autres riches en protéines [57]. Plus précisément, les drusenmiliaires (hard drusen) correspondent à l'accumulation d'un matérielhomogène et hyalin, acide para aminosalicylique positif (PAS+), plutôt lipophile. Cematériel s'accumule à la base des cellules de l'épithélium pigmentaire. L'évolutionde ces drusen se fait parfois par confluence vers l'apparition progressive de drusenséreux (soft drusen). Il y a alors transformation du matériel contenu dans lesdrusen miliaires en matériel plus hydrophile (drusen sérogranulaires) [58, 59]. Les drusen séreuxsont constitués d'un matériel amorphe, plutôt hydrophile. Ce matériel est accumuléentre la membrane basale de l'épithélium pigmentaire et le reste de la membrane de Bruch[59, 60, 61]. Les drusen membraneuxsont composés d'amas de membranes lipidiques qui représentent des épaississementsfocaux du dépôt laminaire basal [60, 62].

Des études concernant la fluorescence des drusen en angiographie ICG ont d'abord étépubliées par Bottoni puis par Scheider [63, 64]. Les résultats de cespremières études n'étaient pas complètement concordants. Plus récemment l'étude deArnold a montré sur 53 yeux le caractère hyperfluorescent des drusen miliaires, lecaractère hypofluorescent des drusen séreux, et l'hypofluorescence des drusen membraneux[62].

L'hyperfluorescence des drusen miliaires est bien cohérente avec les notionsfondamentales présentées plus haut. Une liaison de l'ICG au matériel lipidique decertains drusen a été démontrée par l'étude de Chang [53]. Yoneya a de plus apportéune explication à cette liaison par la présence de pôles hydrophiles au sein desphospholipides présents dans le matériel des drusen [33]. Enfin, rehaussement del'intensité de fluorescence accompagné d'un décalage du spectre d'émission de l'ICGobservé par Mordon et par Ito sont également cohérents avec la modification del'environnement hydrophile/hydrophobe d'une certaine proportion des molécules d'ICG [26, 32]. Ces éléments suggèrentdonc que l'hyperfluorescence des drusen miliaires pourrait être due à une accumulationde molécules d'ICG mais également à un réhaussement de l'intensité de fluorescencedes molécules d'ICG fixées aux phospholipides.

Les drusen séreux, plutôt hydrophiles, apparaissent hypofluorescents et provoquent unmasquage relatif en angiographie ICG [62]. Ces drusen séreuxdérivent de la confluence de drusen miliaires au cours du temps. On assiste ainsi sur desangiographies ICG successives au passage d'une forme hyperfluorescente de drusen à uneforme hypofluorescente. Une fragmentation du matériel des drusen, un changement de lanature de ce matériel sont des hypothèses qui ont été évoquées [61, 62].

La régression de drusen coïncide avec une certaine dégénérescence de cellules del'épithélium pigmentaire pouvant évoluer vers la constitution de plaques d'atrophie. Onobserve alors des variations de sémiologie en angiographie ICG [62]. Plusieurs hypothèses ontété évoquées pour expliquer la séquence de ces variations de sémiologie : laperte d'un effet masque de la mélanine de l'épithélium pigmentaire, la perteprogressive de la choriocapillaire, source de fluorescence. Ces phénomènesinterviendraient pour expliquer soit une hyperfluorescence aux temps précoces, soit unehypofluorescence dans les zones d'atrophie. L'imprégnation progressive de l'épithéliumpigmentaire au cours d'une angiographie ICG décrite par Chang peut également expliquerla perte d'un grisé fluorescent en cas d'atrophie de l'épithélium pigmentaire. Lacoexistence de plusieurs phénomènes est probable et ne simplifie pas les hypothèsesquant aux mécanismes des variations de fluorescence ICG lorsqu'une régression de drusenest suivie de l'apparition de plaques d'atrophie.

Enfin l'hypofluorescence des drusen membraneux malgré leur caractère lipophilepourrait être liée à une absence de structures phospholipidiques, mais cette hypothèsenécessite une confirmation histochimique.

L'imprégnation des néovaisseaux de la DMLA

L'angiographie au vert d'indocyanine a représenté un apport majeur pour le diagnosticdes néovaisseaux occultes de la DMLA. En effet un certain nombre de néovaisseauxchoroïdiens apparaissent sous la forme d'une fluorescence tardive de sourceindéterminée en angiographie à la fluorescéine et sont alors classés« néovaisseaux occultes » (NVO). L'activité de ces néovaisseaux est moindreque celle des néovaisseaux visibles (classiques). Néanmoins leur évolution naturelleest sévère. De plus, les études de la littérature n'ont pas montré d'efficacité dela photocoagulation au laser basée sur les données de l'angiographie à la fluorescéinepour le traitement de ces néovaisseaux occultes [6, 59]. L'angiographie au vertd'indocyanine permet dans une certaine mesure de modifier le statut de cesvaisseaux : dans environ 40 % des cas les NVO isolés sont« transformés » en un lacis vasculaire identifiable aux temps précoces del'examen, surtout avec les SLO. Dans 20 % supplémentaires, au stade tardif (à 30minutes), on observe une fluorescence en plaque, parfois plus étendue que le lacisinitial [65, 66]. Cette meilleureidentification des NVO isolés grâce à l'angiographie ICG laisse entrevoir lapossibilité de photocoagulations « guidées par ICG » [52, 67, 68, 69].

Il n'y a actuellement pas de consensus pour expliquer le mécanisme de la visibilitédes néovaisseaux de la DMLA et en particulier la sémiologie des néovaisseaux occultesisolés : pour certains auteurs l'ICG « colle » aux parois vasculaires,en particulier celles des néovaisseaux [2, 16, 26, 51, 52, 70, 71, 72]. Pour d'autres auteurs,cette explication n'est pas tout à fait satisfaisante et ce serait au contraire unediminution de la fluorescence des tissus périvasculaires qui augmenterait la visibilitédes néovaisseaux sous rétiniens [73, 74, 75].

Flower a rapporté une étude expérimentale comportant des cultures de cellulesendothéliales aortiques humaines montrant une imprégnation et une captation possible del'ICG par ces cellules endothéliales [51]. L'hypothèse d'une fixationplus ou moins sélective de l'ICG sur la paroi des néovaisseaux choroïdiens de la DMLApar rapport aux vaisseaux choroïdiens normaux a été évoquée par les cliniciens [68, 70, 76, 77]. Cette hypothèse estdifficile à prouver car la mise en évidence des néovaisseaux en angiographie infrarougerepose d'après la plupart des auteurs, sur un processus de fuite de l'ICG au niveau deces vaisseaux. Cette fuite est beaucoup plus lente que celle de la fluorescéine observéesur les angiographies en lumière visible [3]. Pour d'autres auteurs la miseen évidence des néovaisseaux de la DMLA repose davantage sur des variations del'hématocrite au sein de ces vaisseaux [46, 74]. La réalité d'une fixationpréférentielle de l'ICG au niveau des néovaisseaux de la DMLA n'est donc pas établie,d'autant que la demi-vie courte de l'ICG impose d'augmenter la sensibilité des imageursau cours de la séquence d'angiographie.

On peut discuter avec Quaranta et Cohen d'une éventuelle affinité de l'ICG pourl'élastine dégénérée, le tissu fibrosé ou des complexes protéocalciques quiexpliquerait par exemple la sémiologie de la vidéoangiographie au cours des striesangioïdes [78]. Cetteaffinité pourrait selon ces auteurs être supérieure à celle de l'ICG pour l'albumine.Enfin, une autre hypothèse fait intervenir le métabolisme des cellules endothélialesdes néovaisseaux sous rétiniens. Un métabolisme élevé est accompagné d'une hyperexpression de récepteurs cellulaires au niveau de l'endothélium, en particulier desrécepteurs aux lipoprotéines. Les lipoprotéines plasmatiques se lient à la fois auxmolécules d'ICG et sur leurs récepteurs cellulaires. Une hyper expression desrécepteurs aux lipoprotéines au niveau des cellules endothéliales des néovaisseauxpourrait provoquer une fixation plus importante de l'ICG par l'intermédiaire deslipoprotéines. Cette hypothèse est soutenue par le caractère tardif (plusieurs fois lademi-vie de l'ICG plasmatique) de l'imprégnation des néovaisseaux sous rétiniens surles clichés d'angiographies et par le caractère amphiphile de la molécule. Lecaractère moins « actif » des néovaisseaux occultes serait ainsi cohérentavec leur visibilité moins constante que celle des néovaisseaux classiques enangiographie ICG.

Les variations du rendement de fluorescence du colorant

Pour certains auteurs, la différence d'hématocrite entre les capillaires, les petitset les gros vaisseaux peut provoquer un changement du rendement de fluorescence du vertd'indocyanine. Comme cela est indiqué plus haut cette modification du rendement peutêtre expliquée par un changement progressif du rapport entre les diffusions de Raleighet de Mie.

SLO ou rétinographe ?

Certains auteurs ont tenté d'expliquer la différence des images acquises avec unScanning Laser Ophthalmoscope (SLO), qu'il s'agisse de l'appareil de Rodenstock®ou de Heidelberg® (HRA) et avec un rétinographe. On observe en effet unedifférence de sémiologie des membranes néovasculaires sous rétiniennes, mieux visiblesaux temps précoces de la vidéo-angiographie au SLO et souvent mieux visibles aux tempstardifs de l'angiographie réalisée avec un rétinographe. La sémiologie desdécollements de l'épithélium pigmentaires vascularisés ou non est égalementdifférente selon que les auteurs utilisent un rétinographe ou un SLO [7, 79, 80, 81].

Pour Wolf, avec le SLO de Rodenstock® environ 50% des membranesnéovasculaires occultes de la DMLA peuvent être délimitées [73]. Par contre pour Yannuzzi,l'information est apportée par les clichés des temps tardifs sur le rétinographe [68].

Dans une étude récente sur 100 yeux présentant des néovaisseaux occultes surl'angiographie à la fluorescéine, Gelisken a montré que l'angiographie ICG réaliséeavec un SLO permet de mieux montrer l'architecture des néovaisseaux (28% de néovaisseauxbien identifiés par le SLO mais 8 % par le rétinographe) mais que les rétinographesmontrent mieux les « hot spots » et les fluorescences en plaque [82].

Plusieurs éléments peuvent entrer en compte pour expliquer ces différences :lemode d'excitation : lampe à flash pour les rétinographes, laser diode pour leSLO de Rodenstock® ou celui de Heildelberg® (HRA). La zone de recouvrement entre lesspectres des filtres d'excitation et de recueil de la fluorescence est de 0,01% sur leSLO de Rodenstock et de 0,5 % sur le rétinographe Topcon d'après Wolf [73]. On analyse des clichésavec le rétinographe et une séquence vidéo avec le SLO. Sur le SLO c'est un point de 20&mgr;m de diamètre qui balaye les 30 degrés du fond d'œil en 32 ms (lapuissance moyenne du laser d'illumination est de 2 mW). Le « SLO single pixeldetector  » intègre l'image en fluorescence du spot de 20 &mgr;m pendant250 nanosecondes. L'irradiance moyenne au niveau de la rétine est de 80 &mgr;J/cm2.Par contre, avec un rétinographe le flash de la caméra illumine simultanément les 50odu champ du fond d'œil (environ 3,2 cm2) pendant environ 15 millisecondes.La durée d'intégration des CCD de la caméra est d'environ 33 millisecondes et toute lalumière du flash contribue donc à la formation de l'image. La puissance du flash varieau cours de la séquence, de l'ordre de 220 &mgr;J/cm2 aux temps précoceset tardifs mais 80 &mgr;J/cm2 aux temps intermédiaires. Contrairement àce qui se passe pour le SLO, tous les pixels de la caméra sont illuminés en même temps.Enfin avec un rétinographe, l'image qui est analysée correspond à l'addition desinformations de toute l'épaisseur des couches choriorétiniennes alors que les SLOpermettent un travail en mode confocal où chaque plan peut être analyséséparément.

Flower a récemment apporté une explication à la différence entre les images desdécollements de l'épithélium pigmentaire non vascularisés (DEP) obtenus avec les deuxtypes de systèmes : ces DEP apparaissent hypofluorescents au SLO (en l'occurrence,l'appareil de Heidelberg) mais hyperfluorescents avec les rétinographes parce qu'un SLOélimine la lumière diffusée au contact des protéines du liquide séreux [83]. De la même manière, lesDEP vascularisés apparaissent plutôt isofluorescents avec les rétinographes maishypofluorescents sur un SLO de Heidelberg.

Actuellement, les progrès des rétinographes (amélioration des optiques, augmentationde la sensibilité des caméras, possibilité d'une excitation par diode) visent àpermettre l'utilisation des informations des temps précoces de l'angiographie ICG.

Angiographie ICG et pathologies inflammatoires

Les pathologies inflammatoires du segment postérieur constituent une des indicationsà réaliser une angiographie ICG [84, 85, 86]. On observe en particulierdes zones d'hyper ou le plus souvent d'hypofluorescence. Les aspects sont différentsselon le stade de la pathologie et différents suivant le temps de la séquenced'angiographie au vert d'indocyanine ce qui rend difficile l'interprétation des images.

Lors d'une étude expérimentale sur des uvéites autoimmunes chez le rat, des auteursn'ont pas observé de fuite de colorant au dépend des gros vaisseaux choroïdiens. Ilsont par contre observé des fuites d'ICG au dépend de vaisseaux rétiniens correspondantà des zones d'hyperfluorescence. Ces zones de fuite en angiographie ICG étaientcorrélées avec l'intensité de l'inflammation [87].

Herbort et LeHoang ont récemment présenté l'étude de 300 cas d'uvéitespostérieures analysés dans deux centres. Pour ces auteurs, les temps intermédiairesautour de la 12e minute sont les plus contributifs. Les zonesd'hyperfluorescence correspondraient à des phénomènes de fuite (leakage) ou àdes phénomènes d'imprégnation (staining) au niveau de la choriocapillaire, desgros vaisseaux choroïdiens ou des vaisseaux rétiniens. Les zones d'hypofluorescencecorrespondraient à des défauts d'imprégnation de la choroïde soit liés à uneatrophie du tissu vasculaire, soit liés à la présence d'un processus occupant del'espace au sein du tissu choroïdien. Les auteurs ont élaboré un protocole deréalisation et d'interprétation des angiographies ICG dans les uvéites postérieuresdestiné à permettre de mieux comprendre les images [84].

Vert d'indocyanine et fluorescéine sodique

Comparée à la fluorescéine, l'ICG présente d'abord une structure moléculaire trèsdifférente d'où des propriétés physico-chimiques différentes. La fluorescéinepossède une masse moléculaire plus petite et un faible coefficient de partage (peulipophile). L'ICG, dont la masse est environ deux fois plus importante est de nature trèsamphiphile (tableau II) .

Le passage transmembranaire de ces molécules est plus documenté concernant lafluorescéine. Ce passage s'effectue par diffusion au travers de la membrane et estdépendant du pH. La diffusion de la fluorescéine au travers des membranes est largementdécrit en biologie cellulaire et en ophtalmologie. L'ICG n'a pas fait l'objet de tellesétudes. Une étude de la pénétration de l'ICG dans des cellules en culture fait étatde l'hypothèse selon laquelle l'ICG pénétrerait par transport actif et saturable sur labase des cinétiques observées [51].L'ICG est décrit comme généralement confiné dans la circulation mais pouvant franchircertaines barrières biologiques dans des pathologies précises. Toutefois, son affinitépour les phospholipides est démontrée.

Ces différences entre les deux molécules peuvent constituer autant« d'inconnues à l'équation » de l'interprétation des images pour lescliniciens familiarisés à l'interprétation des angiographies à la fluorescéine. Levocabulaire d'interprétation des angiographies à l'ICG est d'ailleurs basé sur lasémiologie des images obtenues avec la fluorescéine. Comme l'ont fait remarquer Herbortet LeHoang, ce vocabulaire n'est pas toujours adapté puisque les molécules sont trèsdifférentes [84].

CONCLUSION

La description d'une sémiologie rétinienne a suivi de peu le début de l'utilisationde la fluorescéine pour les angiographies en ophtalmologie. Par contre, pour l'ICG,après l'étape des angiographies par absorption puis le regain d'intérêt apporté parla numérisation, la description d'une sémiologie est beaucoup plus lente. Ce décalagepeut être expliqué par le fait que l'ICG permet une imagerie de toute l'étendue descouches chorio-rétiniennes en rapport avec le spectre infrarouge de la fluorescence.L'analyse d'une sémiologie correspondant à plusieurs structures différentes sur lamême image ne simplifie pas l'interprétation. De plus l'utilisation du rendement defluorescence faible de l'ICG avec un processus d'amplification important peut être unesource d'erreur s'il existe une zone de recouvrement des filtres d'excitation etd'émission. En l'occurrence, il nous semble étonnant que peu d'études de lalittérature ophtalmologique ne fasse mention des spectres des filtres utilisés pourobtenir les images des temps tardifs sur les rétinographes.

Sur le plan physicochimique, le caractère amphiphile, les affinités complexes ducolorant pour les éléments plasmatiques et les structures phospholipidiques, lacomplexité du métabolisme et des différents mécanismes du rendement de fluorescencecontribuent largement à la difficulté d'interprétation des séquences d'images. Uneétude récente illustre le rôle de la liposolubilité d'une molécule fluorescente pourson utilisation en clinique : 3 molécules dont le spectre de fluorescence et lastructure biochimique sont très proches mais la liposolubilité différente ont étécomparées : la fluorescéine sodique, la calcéine et la carboxyfluorescéine. Lesimages d'angiographie rétinienne obtenues avec ces 3 colorants sont extrêmementdifférentes, principalement parce que la liposolubilité peut expliquer le degré deconfinement au sein des vaisseaux choroïdiens [88]. Dans le cas du vertd'indocyanine, l'utilisation dans le spectre infrarouge d'un colorant fluorescent, dont lastructure biochimique proche de l'ICG mais dont la liposolubilité serait différentepourrait apporter une contribution à l'interprétation du comportement in vivo dela molécule.

Ainsi, la compréhension des images d'angiographie ICG n'est pas aussi intuitive quecelle des angiographies en lumière visible. Une interprétation plus complète des imagesfait intervenir des notions telles que le rendement de fluorescence ou l'affinité desmolécules pour les phospholipides. Seules des études réunissant des travauxexpérimentaux et des connaissances cliniques ont récemment permis de mieux comprendreces notions.

L'enjeu de ces progrès dans l'interprétation des images est une meilleurecompréhension et un traitement mieux adapté des pathologies médicales du segmentpostérieur.

 

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Tableau I.

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Tableau II.

a

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b - Caractéristiques physico-chimiques.

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Figure 1.

Figure 1A. Rotation progressive de la molécule d'ICG vue « deface » de la droite vers la gauche. On observe les deux parties polycycliques(benzoindotricarbocyanine) reliés entre elles par une chaîne poly carbonée. Sur chaquenoyau indol une chaîne carbonée porte un groupement sulfate (rouge et orange). En bleufigure un ammonium quaternaire.  

Figure 1B. Vue « supérieure (à 90 degrés par rapport à la vue de lafigure 1a). Remarquer l'angulation des groupements sulfates et des groupementspolycycliques. Figures reproduites avec l'aimable autorisation du Dr Akira Dobashi [9].  

 

 

Figure 2. Modélisation de l'élimination du vert d'indocyanine selon une monoexponentielle décroissante. Graphique établi d'après les données de Cherrick, Ott,Flock, McEvoy [11, 12, 14, 15].

 

 

Figure 3. Modélisation de l'élimination du vert d'indocyanine selon une biexponentielle décroissante comparée à une modélisation mono exponentielle. Échellelogarithmique pour les ordonnées . Graphique établi d'après les données de Ott [15].

 

 

Figure 4. Variations du spectre d'absorption de l'ICG en fonction de laconcentration dans l'eau d'après les données de Landsman [3]. Concentration en micromoles.L'aspect « en miroir » autour de 740 nm traduit le spectre d'absorptiondifférent des agrégats d'ICG, dont la proportion augmente avec la concentration.

 

 

Figure 5. Variations du spectre d'absorption de l'ICG en fonction de laconcentration plasmatique d'après les données de Landsman [3]. Concentrations en micromoles.

 

 

Figure 6. Schématisation des variations de la diffusion du rayonnement issu de lafluorescence de l'ICG en fonction de variations de l'hématocrite : variation de laproportion des modes de diffusion optique de la lumière de fluorescence selon le mode deRaleigh ou selon le mode de Mie. Pour simplifier le schéma, seuls des rayonnementsverticaux de la lumière de fluorescence avant diffusion ont été représentés.

 

 

Figure 7. Influence de la concentration sur le rendement de fluorescence de l'ICG.

 

 

Figure 8. Cliché en lumière verte (anérythre). Cliché Dr Desmettre : Canon60 UVi©, Canon Europe ; Oculab®, Life Science Resources Ltd.

 

 

Figure 9. Temps précoce de l'angiographie ICG chez le même patient. Remarquer lavisibilité des vaisseaux choroïdiens et l'augmentation de l'intensité de fluorescenceau niveau des croisements des vaisseaux traduisant l'addition de l'intensité defluorescence. Cliché Dr Desmettre : Canon 60 UVi ©, Canon Europe ;Oculab ®, Life Science Resources Ltd.



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