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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 23, N° 8  - octobre 2000
p. 821
Doi : JFO-10-2000-23-8-0181-5512-101019-ART14
Dossier thématique : DMLA - Revues générales

Propriétés de fluorescence et particularités métaboliques de la fluorescéine
 
FORMATION MÉDICALE CONTINUE

REVUES GÉNÉRALES

Journal Français d'Ophtalmologie2000; 23: 821-834
© Masson, Paris, 2000

T. Desmettre (1) (2), J.-M. Devoisselle (3),S. Mordon (1)

(1)UPRES EA 2689-INSERM IFR22, Pavillon Vancostenobel, CHU Lille, 59037Lille Cedex.
(2)Centre Ophtalmologique d'Imagerie & Laser, 59130 Lambersart.
(3)Laboratoire de Technique Pharmaceutique Industrielle, UFR des sciencespharmaceutiques, 34060 Montpellier Cedex 01.

  • Introduction
  • Basics
  • The fluorescein molecule
  • Spectra
  • Modifications of the fluorescence properties
  • Interaction with components that quench fluorescence
  • Influence of fluorescein concentration
  • Influence of fluorescein fluorescence with hemoglobin
  • Influence of pH variations
  • Pharmacokinetics
  • Metabolism
  • Affinities, Extravasation
  • Control of retinal damage
  • Some clinical use of fluorescein out of the classic use of fluorescein angiography
  • Control of corneal damage
  • Fluorescein angiography out of Ophthalmology
  • Sodium fluorescein and Indocyanine green
  • Conclusion

Key words : Fluorescence. , fluorescein. , angiography.

  • Introduction
  • Aspects fondamentaux
  • Description de la molécule
  • Caractéristiques spectrales
  • Facteurs influençant les propriétés de fluorescence
    • Interaction avec des composés diminuant la fluorescence
    • Influence de la concentration du colorant
    • Influence de l'épaisseur de la couche sanguine : interaction lumière/colorant
    • Influence des variations de pH
  • Pharmacocinétique
  • Métabolisme
  • Affinités, Diffusion
  • Le contrôle du dommage rétinien

    Aspects cliniques en dehors des indications classiques de l'angiographie rétinienne

    • Le contrôle du dommage cornéen
    • Applications de l'angiographie à la fluorescéine en dehors de l'ophtalmologie

  • Fluorescéine sodique et vert d'indocyanine
  • Conclusion

Mots clés : Fluorescence. , fluorescéine. , angiographie.


INTRODUCTION

Selon l'expression du professeur Coscas, 4 coïncidences heureuses ont fait lesuccès de l'angiographie à la fluorescéine en ophtalmologie : (i) la grandesolubilité de ce colorant en solution aqueuse et sa faible toxicité, qui autorisent uneinjection intraveineuse chez l'homme à des concentrations élevées, (ii) le spectred'émission dans le domaine du visible qui a permis de réaliser des clichésphotographiques dès le début des années 1960, (iii) la relative imperméabilitédes barrières hémato rétiniennes pour la fluorescéine lorsqu'elles sont normales, etenfin (iiii) la relative opacité optique de l'épithélium pigmentaire au rayonnement defluorescence de la molécule [1].En effet, ces 4 coïncidences font tout l'intérêt de l'angiographie en fluorescenceà la fluorescéine pour l'ophtalmologie. Les anomalies des barrières hématorétiniennes interne et externe sont particulièrement mises en évidence sous la forme defuites du colorant et les défauts de l'épithélium pigmentaire sont décelés en raisonde leur transparence pour le rayonnement émis par la fluorescéine présente au niveaudes vaisseaux choroïdiens [1],[2].

Cependant, alors que l'angiographie à la fluorescéine est devenue un examen deroutine pour la prise en charge des patients atteints d'affections rétiniennes, deuxéléments nouveaux sont intervenus depuis le début des années 1990. Tout d'abord,la numérisation qui a encore accru l'intérêt des techniques d'imagerie par fluorescencepour l'ophtalmologie, en particulier parce que les images sont maintenant disponibles audécours immédiat de l'examen [3],[4], parce que ces images sontdes fichiers informatiques aisément copiés ou transférés et également parce quel'intensité de fluorescence est quantifiable [5]. Ensuite, la possibilité deréaliser de façon courante des angiographies dans le spectre infrarouge avec le vertd'indocyanine est venue modifier notre pratique quotidienne. Elle a aussi modifiécertaines de nos interprétations des images d'angiographie à la fluorescéine. Ces deuxéléments ont aussi amené des questions concernant le métabolisme et les propriétésde fluorescence des fluorophores utilisés en ophtalmologie.

Le but de cette mise au point est alors d'illustrer les coïncidences qui ont fait lesuccès de l'angiographie à la fluorescéine à travers les principales propriétésfondamentales de la molécule, qu'il s'agisse de ses propriétés optiques ou de sespropriétés pharmacocinétiques. La prise en compte de ces propriétés nous aide eneffet dans notre pratique quotidienne pour une meilleure compréhension des clichésd'angiographie.

ASPECTS FONDAMENTAUX

Description de la molécule

En 1871, Baeyer donna le nom de phtaléines à des colorants qu'il avait synthétiséen condensant de l'anhydride phtalique et des dérivés phénoliques. On synthétise ainsila phtaléine du phénol ou phénol phtaléine, et la phtaléine du résorcinol oufluorescéine. Le rose Bengale et l'éosine sont deux colorants dérivés de lafluorescéine appartenant à la famille des xanthènes.

La fluorescéine sodique est isotonique à une concentration de 3,34 % ce quipermet de l'utiliser par voie injectable. La figure 1 montre unereprésentation en 3 dimensions de la molécule et permet d'observer l'angulationentre les différents groupements polycycliques [6]. Les tableau I, tableau II, tableau III résument lesprincipales caractéristiques de la molécule , tableau I, tableau II, tableau III.

C'est la présence d'une structure polycyclique qui permet la délocalisation desélectrons et confère alors des propriétés de fluorescence qui font tout l'intérêt decette molécule en clinique. La fluorescéine est présente dans différentesspécialités pharmaceutiques : la fluorescéine sodique Faure™ (10 % et20 %) et la fluorescéine sodique Serb™ (10 %).

La possibilité d'allergies à la molécule de fluorescéine dans la populationgénérale implique une conduite à tenir préventive et curative en cas d'incident oud'accident [7] [8] [9]. Certains auteurs ont mêmeproposé l'administration de la fluorescéine par voie orale de façon à diminuer larapidité de survenue et la sévérité d'une complication allergique éventuelle [10], [11].

Caractéristiques spectrales

Le positionnement dans la partie visible du spectre de fluorescence de la fluorescéineest l'élément primordial qui a permis la découverte du caractère fluorescent de lamolécule tableau I.C'est aussi l'élément qui a conditionné, dés le début des années 1960 lapossibilité d'exploiter la fluorescence de la molécule au sein des vaisseaux rétinienssous la forme de clichés photographiques standards [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19].

Il faut bien remarquer que les spectres d'absorption (c'est-à-dire excitation) etd'émission de la fluorescéine sont différents en solution aqueuse, dans le plasma ou lesang total figure 2. Eneffet, immédiatement après injection intraveineuse, la liaison aux protéinesplasmatiques provoque un déplacement de 13 nm du spectre d'absorption vers lesgrandes longueurs d'ondes. Le pic de fluorescence maximum passe de 490 nm à503 nm [20]. Cedéplacement du spectre correspond au changement de l'environnement physico-chimique de lamolécule au cours des premières secondes après l'injection. Le pic d'émission de lafluorescéine est décrit à 515 nm. De la même manière, en solution plasmatique,ce pic d'émission est légèrement déplacé vers les plus grandes longueurs d'ondes à518 nm figure 2 [20]. Le déplacement del'émission sur 3 nanomètres n'intervient bien entendu pas en clinique lors de laréalisation d'angiographies mais il illustre l'interaction des molécules defluorescéine avec leur micro-environnement.

La situation du spectre de la fluorescéine dans la partie visible et les possibilitésd'interaction de la lumière de fluorescence avec la mélanine de l'épithéliumpigmentaire font toute la particularité des images d'angiographie par rapport à cellesqui sont obtenues avec le vert d'indocyanine [1], [21] [22] [23] [24]. Les anomalies de cetépithélium pigmentaire seront particulièrement bien mises en évidence par lafluorescence du colorant qui ne sera alors plus masquée par l'épithélium pigmentairetel que cela est illustré par « l'effet fenêtre » sur la figure 3.

Le terme d'effet fenêtre est d'ailleurs réducteur puisqu'il ne résume pas lasémiologie des anomalies de l'épithélium pigmentaire. Lorsque la choriocapillaire ettoute l'épaisseur de la choroïde sont le siège d'une atrophie, seule l'imprégnationtardive de la sclére par le colorant est visible et l'on assiste pas comme lorsque lachoroïde est respectée à une hyperfluorescence précoce [14].

Facteurs affectant la fluorescence

La fluorescence d'un fluorophore fait intervenir des phénomènes complexes dediffusion, réflexion, transmission et absorption du rayonnement visible de la lumièreexcitatrice, mais aussi de la lumière de fluorescence sur les molécules tissulaires [25], [26]. Il est important deconnaître l'existence de ces phénomènes et d'en apprécier le retentissement éventuelsur la sémiologie angiographique.

En ce qui concerne la fluorescéine, les facteurs principaux sont l'interaction decomposés diminuant la fluorescence, la concentration de la fluorescéine, l'épaisseur dela couche de solution déterminant l'importance de la lumière absorbée, enfin le pH dela solution. Par ailleurs, une certaine fluorescence du sérum dans le spectre visible(excitation à 340 nm, émission à 480 nm) a pu être mise en évidence. Cetélément peut procurer un effet d'excitation par relais [27].

Interaction avec des composés diminuant la fluorescence

L'interaction de la fluorescéine avec certains composés tels que les protéinesplasmatiques diminue fortement sa fluorescence. En particulier, la liaison de l'albumineaux molécules de fluorescéine provoquerait une chute de 55 % de son rendement defluorescence et selon certains auteurs, durant l'angiographie seules les molécules nonliées seraient fluorescentes [28].Pour la plupart des auteurs, après injection, la proportion des molécules defluorescéine liées seraient de 83 % pour l'albumine humaine [29] et de 85 % pour laliaison aux protéines [30].

Cette liaison à l'albumine est de faible affinité et dépend de la concentration ducolorant. Des travaux montrent ainsi que la fraction de fluorescéine non liée esthautement dépendante de la dose administrée, ainsi pour une dose de 12,5 mg/Kg, lafraction libre plasmatique est de 0,04 mg/ml alors que pour une dose de125 mg/Kg, cette fraction est de 0,29 mg/Kg [31], [32].

L'influence de la concentration du colorant

Le rendement de fluorescence de la fluorescéine varie en fonction de sa concentrationdans le sang total. L'extinction de la fluorescence provoquée par l'augmentation de laconcentration est souvent appelée « quenching » dans la littérature.Un rendement de fluorescence maximum est atteint pour des concentrations de 20 mg/ml (0,002 %). Pour des concentrations supérieures,le rendement de fluorescence diminue [27]. Cette diminution est due àun phénomène d'auto-association des molécules de fluorescéine (agrégation). Cesagrégats sont non fluorescents et peuvent en outre absorber partiellement la lumière.Ainsi, pour des doses permettant d'atteindre localement des concentrations de quenchingdans des artères rétiniennes, l'intensité de fluorescence de ces artères serainférieure à celle obtenue avec des concentrations en dessous du seuil de quenching[33]. On comprend alorsl'intérêt de l'utilisation habituelle d'une ampoule de 0,5 mg de fluorescéine à10 %, injectée en quelques secondes pour la réalisation d'une angiographierétinienne. L'utilisation d'une dose supérieure peut augmenter l'intensité defluorescence aux temps tardifs mais n'augmentera pas nécessairement le contraste ni ladéfinition des images aux temps précoces.

Influence de l'épaisseur de la couche : interaction lumière tissu

Le spectre de l'hémoglobine et de ses dérivés se superpose en partie avec le spectred'émission de la fluorescéine. Cette particularité se traduit en clinique par unecertaine absorption de la lumière de fluorescence par les vaisseaux de gros calibre figure 4. De la mêmemanière, la diminution du calibre des capillaires augmente l'efficacité de lafluorescence [27], [34].

Pour certains auteurs, cette propriété d'absorption de la lumière visible parl'hémoglobine a également été évoquée pour expliquer l'aspect laminaire des veinesaux temps précoces de l'angiographie [27]. Il semble cependant que cemécanisme ne puisse pas être responsable à lui seul de cet aspect. En effet, d'une partil est possible d'observer un aspect laminaire veineux lors d'une angiographie au vertd'indocyanine (et l'hémoglobine n'absorbe pas le rayonnement de fluorescence du procheinfrarouge), d'autre part au niveau des croisements veineux, on peut observer un filetfluorescent au centre du vaisseau réunissant les deux veines de moindre calibre figure 6. Les différencesde cinétique entre le centre et la périphérie des vaisseaux de moyen calibre expliquentqu'aux temps précoces la concentration de fluorescéine soit plus importante enpériphérie des veines qu'au centre. C'est cette différence des concentrations localesqui donne l'aspect laminaire.

Enfin, il faut signaler un autre aspect de l'influence de l'hémoglobine : environ17 % des molécules de fluorescéine se fixent aux globules rouges [33], [35]. L'hémoglobine modifieégalement le spectre d'émission de la fluorescéine en raison de l'absorption d'unecertaine partie du rayonnement de fluorescence qui est émis [33]. Il existe aussi unedifférence d'absorption de l'hémoglobine réduite par rapport à celle del'oxyhémoglobine [36], [37]. Le spectre d'émission dela fluorescéine dans une artère est alors discrètement différent de celui obtenu auniveau d'une veine, comme cela est illustré sur la figure 2 sur la courbe enpointillés.

La sensibilité aux variations de pH

La fluorescéine n'est fluorescente en clinique qu'en raison du caractère légèrementalcalin du pH sanguin et il s'agit finalement là aussi d'une coïncidence heureuse. Eneffet, la présence d'un groupement carboxylique confère à la molécule de fluorescéineune certaine sensibilité aux variations de pH. Certains auteurs ont montré la présencede différentes formes de la molécule tableau II [33], [38]. Chaque forme a un pouvoird'absorption différent et la proportion respective de ces différentes formes varie avecle pH du soluté. Le spectre d'absorption (c'est-à-dire d'excitation) de la fluorescéineen fonction du pH correspond alors à la superposition des spectres de ces différentsdérivés de la molécule [38].La forme neutre de la fluorescéine, prépondérante entre les valeurs 2 et 4 du pH,a une absorption d'intensité bien inférieure à celle des autres formes alors que laforme bianionique est prépondérante pour les valeurs de pH supérieures à 7 tableau IV [33]. Ainsi, la fluorescence dela molécule apparaît en milieu alcalin et s'estompe en milieu acide figure 6. Nous reverrons,dans le paragraphe consacré à la diffusion et l'extravasation de la fluorescéine,l'importance de ces différentes formes de la molécule, dont la proportion diffère avecle pH.

Aspects pharmacocinétiques, et comportement in vivo

Après injection intraveineuse, la fluorescéine est rapidement retrouvée au niveau dufoie sous forme conjuguée. La molécule subit ensuite une élimination rénale, commeillustré sur la figure 7.Les études sur la cinétique d'élimination de la fluorescéine sont pour la plupartbasées sur l'étude de la fluorescence au cours des angiographies. Après injection d'unbolus intraveineux la concentration sanguine suit une décroissance biexponnentielle quipeut être modélisée selon un modèle à deux compartiments [29], [39], [40], [41]. Le temps de demi vieplasmatique est de l'ordre de 1,7 minute [42], [43].

Après injection intraveineuse, la concentration sanguine de la fluorescéine estaugmentée d'un facteur (1-Hématocrite) en raison de sa localisation dans le compartimentextracellulaire. Cependant, par rapport à la valeur ainsi calculée, la concentrationmesurée est inférieure de 10 % en raison de l'absorption de molécules defluorescéine à la surface des globules rouges [20].

Il faut remarquer que les notions sur la pharmacocinétique de la fluorescéine sontissues de travaux menés dans des applications très différentes. La diversité desmodèles étudiés et des natures de vascularisation (gros troncs, ou microcirculation)permet d'aboutir à des cinétiques qui ne sont pas complètement comparables [23].

Métabolisme

Trois métabolites principaux ont été retrouvés au niveau des urines. Un seul estfluorescent, il s'agit de la fluorescéine monoglycuroconjuguée [15], [29], [33], [39], [40] figure 7 , tableau V. Ce composé estobtenu par la liaison à la fluorescéine d'un acide glucuronique par une liaison éther.

Jusqu'à une heure après injection intraveineuse, la concentration plasmatique de lafluorescéine est encore dominante. Après 1 heure, la concentration de lafluorescéine monoglycuroconjuguée est supérieure à celle de la fluorescéine au niveauplasmatique ainsi qu'en chambre antérieure. Comme le montre le tableau I, les spectres dumétabolite sont peu différents de ceux de la fluorescéine [44]. Par contre, on montre qu'enutilisant une excitation à 494 nm et une émission à 516 nm, le rendement defluorescence de la fluorescéine est de 34 fois celui de son métabolite [45]. C'est seulement30 minutes après l'injection de la fluorescéine que le rapport des concentrationss'inverse à 28 en faveur du métabolite glycuroconjugué [39]. En pratique clinique cesont donc surtout la différence des concentrations et la différence de rendement defluorescence qui permettent d'éviter une confusion entre la fluorescence due à lafluorescéine et la fluorescence due à la fluorescéine glucuronide lors des tempsprécoces de l'angiographie.

Diffusion, perméabilité

Pour la plupart des auteurs, la fluorescéine est le colorant permettant l'imagerie desbarrières hémato rétiniennes [46][47] [48] [49] [50]. Les milieux intraoculairessont en effet isolés du secteur vasculaire par des barrières jonctionnelles. Cesbarrières sont caractérisées par la présence de jonctions serrées (tightjunctions). Au niveau du segment antérieur il s'agit de la Barrière Hémato Aqueuse(BHA). Au niveau du segment postérieur il s'agit de la Barrière Hémato Rétinienne(BHR) interne (vascularisation rétinienne) et externe (épithélium pigmentaire). Lesbarrières jonctionnelles possèdent toutes les propriétés d'une membrane cellulaire [51]. Elles constituent un milieulipidique hydrophobe. Les propriétés de diffusion au travers de cette membrane peuventêtre altérées soit par un processus pathologique intéressant des élémentsnormalement présents au niveau de la rétine (e. g. processus inflammatoire tel qu'unevascularite), soit par l'envahissement anormal des structures sous- rétiniennes par deséléments qui ne possèdent pas ces barrières (néovaisseaux sous-rétiniens de laDégénérescence Maculaire Liée à l'Âge) [52] [53] [54]. La plus grande partie de lasémiologie angiographique rétinienne correspond alors à l'analyse des processus dediffusion de la fluorescéine à travers les BHR.

La fluorescéine est une molécule relativement hydrophile tableau II, tableau III. Sasolubilité dans l'eau, est de 50 % à 15° C. Cette hydrophilie expliquequ'elle soit injectable à des pourcentages masse/volume élevés (10 et 20 %).Néanmoins, la molécule possède aussi un certain degré de liposolubilité (lecoefficient de partage à pH 7,38 est de 4,9) [33]. Cette liposolubilité de laforme « hydrophile-libre » peut lui autoriser une certaine diffusion au seindes tissus. En outre, bien qu'à pH physiologique, la fluorescéine soit majoritairementsous une forme hydrophile, une faible proportion de forme monoanionique est présente tableau II. Cette formemonoanionique est davantage lipophile et donc capable d'une diffusion à travers desbicouches phospholipidiques telles que les membranes cellulaires ou les barrièresjonctionnelles. Enfin, la forme liée aux protéines représente une entité dont lataille ne lui permet pas de traverser les barrières.

Il faut en outre considérer que les mécanismes de passage de la fluorescéinedifférent probablement selon les propriétés des barrières biologiques (jonctionsintercellulaires, mécanismes de transport spécifiques). En effet, le transport pardiffusion simple n'est pas le seul mécanisme mis en jeu et un système de transportd'anions a été cité dans la littérature [47]. Les mécanismes évoquéspour la sortie du lit vasculaire seraient de type transport actif de la fluorescéine etde son métabolite. Dans le sens de la rentrée vers le lit vasculaire ces deux moléculesdiffuseraient de façon passive [55].L'absence de techniques non invasives ne permet cependant pas de distinguer ou dequantifier l'importance de différents modes de diffusions (diffusion passive, mécanismede diffusion par transporteur). La part spécifique de la diffusion du métabolitefluorescent, la fluorescéine glucuronide reste également inconnue [39].

C'est bien entendu l'absence de diffusion de la forme hydrophile-libre et de la formeliée aux protéines au travers des barrières hémato rétiniennes, quand elles sontnormales, qui a fait l'intérêt de l'angiographie à la fluorescéine en ophtalmologie.Par contre, la possibilité d'une diffusion, même peu importante de la formemonoanionique et du métabolite glycuroconjugué pourrait être prise en compte lorsquel'on analyse des clichés très tardifs d'angiographie notamment chez les patientsatteints de choriorétinite séreuse centrale ou chez les patients diabétiques.

Le corollaire de ces propriétés pourrait être la possibilité d'utiliser pour laréalisation d'angiographies des colorants proches de la fluorescéine. Fang a illustréle rôle de la liposolubilité d'une molécule fluorescente pour son utilisation enclinique en comparant 3 molécules dont le spectre de fluorescence et la structurebiochimique sont proches mais la liposolubilité différente : la fluorescéine, lacalcéine et la carboxyfluorescéine. Les images d'angiographie rétinienne obtenues avecces 3 colorants sont extrêmement différentes, principalement parce que laliposolubilité est un facteur déterminant du degré de confinement au sein des vaisseauxchoroïdiens [30].

ASPECTS CLINIQUES EN DEHORS DES INDICATIONS CLASSIQUES DE L'ANGIOGRAPHIE RÉTINIENNE

Bien que la fluorescéine soit principalement connue en ophtalmologie pour lesindications classiques de l'angiographie rétinienne, il nous est apparu important deregrouper ici, d'autres indications de l'utilisation de la fluorescéine en ophtalmologie,même si certaines sont encore potentielles comme la quantification du dommage rétinien.Ces autres indications sont en effet directement reliées aux propriétés fondamentalesde diffusion de la molécule et permettent alors d'envisager de façon très globalel'utilisation de la fluorescéine en ophtalmologie.

Quantification de dommage rétinien induit par laser

Alors que l'angiographie à la fluorescéine a connu un développement qui abouleversé les applications de rétine médicale, un aspect est resté peu exploré enophtalmologie, celui de la possibilité d'une quantification de l'intensité defluorescence. L'utilisation récente d'images numérisées permet par contre de mesureraisément l'intensité de fluorescence sur une échelle de gris.

Les impacts de photocoagulation rétiniens correspondent à un dommage dontl'intensité croît vers le centre en fonction de la répartition du gradient detempérature [56] [57] [58] [59] [60]. Lorsqu'ils sont moyennementdosés, ces impacts apparaissent en angiographie sous la forme d'une image en cocarde avecune simple rupture de la barrière hémato-rétinienne au sein de l'anneau périphériqueet un aspect plus sombre vers les anneaux centraux où le colorant ne diffuse quetardivement en raison des modifications de l'architecture tissulaires [61], [62] figure 8. En outre, lafaible intensité de fluorescence au centre des impacts pourrait être lié à desmodifications du pH au sein des tissus lésés avec une acidification relative [63].

Au vu de ces images, certains auteurs ont récemment montré la possibilité dequantifier l'intensité des photocoagulations rétiniennes en utilisant une modélisationmathématique qui fait intervenir la diffusion de la fluorescéine au sein du tissu lésé[64].

Surtout, de nombreux auteurs ont montré la sensibilité particulière del'angiographie qui permet de détecter et de quantifier un dommage thermiqueinfraclinique, c'est-à-dire non visible au biomicroscope [5], [62], [65], [66]. Roider a montré quel'angiographie pouvait être jusqu'à 4 fois plus sensible que l'observation aubiomicroscope pour détecter des impacts de photocoagulation peu dosés [67]. L'intérêt de cettetechnique en pratique clinique reste encore à établir, mais elle pourrait concerner desapplications où un dommage sélectif de l'épithélium pigmentaire est souhaitable, parexemple lors de la photocoagulation des drusen séreux de la DMLA, lors de laphotocoagulation du point de fuite d'une choriorétinopathie séreuse centrale [5], [66], [68].

De la même manière, il pourrait être possible de contrôler un dommage rétiniend'origine inflammatoire.

Quantification du dommage de l'épithelium cornéen

L'épithélium cornéen constitue une barrière importante à la pénétration desprincipes actifs. Les molécules ayant une structure lipophile pénètrent facilement àtravers cette barrière épithéliale. En revanche, leur structure lipophile limitebeaucoup leur diffusion à travers le stroma cornéen. Au contraire, les molécules quiont une structure très hydrophile sont difficilement dissoutes dans le film lacrymal etne parviennent pas à haute concentration au niveau de l'épithélium. Les médicamentsqui ont une bonne pénétration cornéenne ont une solubilité intermédiaire en milieuhydrophile et lipophile qui leur autorise à la fois une pénétration à traversl'épithélium et le stroma [69].Le caractère relativement hydrophile de la molécule de fluorescéine empêche sonpassage au travers de l'épithélium cornéen, par contre, le stroma cornéen estdavantage perméable au passage de cette molécule. Une lésion de l'épithélium cornéenpeut être alors être marquée par la fluorescéine et ce colorant est utilisée demanière quotidienne par les ophtalmologistes pour identifier et quantifier les lésionsde l'épithélium cornéen au cours des pathologies traumatiques ou infectieuses [33], [50], [70] figure 9. De plus, lecollyre à la fluorescéine est utilisé dans de nombreux protocoles expérimentaux pourquantifier la vitesse de cicatrisation de l'épithélium cornéen après utilisation d'unagent irritant ou après réalisation d'une kératectomie photo réfractive [70] [71] [72].

Certains auteurs ont proposé de réaliser un contrôle très précis du dommage del'épithélium cornéen utilisant la fluorescéine [73]. La desquamation naturellede l'épithélium interfère avec cette possibilité de contrôle : une imprégnationphysiologique de la cornée par la fluorescéine est en rapport avec cette desquamation.Par ailleurs, la diffusion de la fluorescéine au sein du stroma à partir de la zone derupture tend à faire surestimer l'étendue de cette zone. Pour ces deux raisons, uncontrôle du dommage de l'épithélium cornéen demande à être réalisé dans desconditions précises concernant la durée de l'imprégnation, le délai entrel'instillation de la fluorescéine et la mesure de la surface fluorescente. Enparticulier, Magada et Mayer ont développé un test quantifiant l'irritation oculaire aumoyen de l'imprégnation cornéenne par la fluorescéine [74].

Applications en dehors de l'ophtalmologie

À la veille de l'an 2000, alors que de plus en plus de disciplines médicalessont concernées par l'imagerie optique grâce tout particulièrement au développement del'endoscopie, de la coelioscopie, de la microscopie, il est assez surprenant qu'aucunediscipline n'ait recours à l'angiographie de fluorescence de façon systématique.Aujourd'hui, les applications de l'angiographie de fluorescence en dehors del'ophtalmologie se limitent à quelques études. Certaines d'entre elles sont néanmoinsrelativement récentes et peuvent laisser présager des développements futurs. Lesétudes les plus anciennes ont concerné les insuffisances veineuses chroniques [75] [76] [77]. Le couplage de l'imageriede fluorescence à des moyens informatiques a permis à Scheffler de montrer l'intérêtde la « computer-assisted fluorescein perfusography » comme techniquediagnostique et pronostique chez les patients atteints de maladie artérielle occlusivepériphérique [78].

Une autre application concerne la neurochirurgie et le diagnostic des fuites de liquidecéphalo-rachidien lors des fractures de l'étage antérieur de la base du crâne [79], [80].

Plus récemment, l'angiographie de fluorescence par voie endoscopique a été proposéepar plusieurs équipes afin de mieux documenter les atteintes de la muqueuse gastrique [81], [82]. Grâce à cette technique,les auteurs ont pu définir plus précisément les ulcérations de la muqueuse(observation d'images en cocarde). Dans le cas de récidive de la maladie de Crohn, il aété possible d'observer des lésions à un stade précoce, qui restaient invisibles avecl'imagerie endoscopique conventionnelle figure 10. Enfin avec unetechnique endoscopique similaire, chez des patients présentant un sepsis sévère, undélai dans l'apparition de la fluorescence au niveau gastrique a pu être observé.L'imagerie de fluorescence a permis d'autre part de révéler des hyperfluorescenceslocalisées, et ce en l'absence de toute traduction pathologique en endoscopie standard [83]. Comme c'est le cas enophtalmologie, l'angiographie de fluorescence permet des études originales de lavascularisation tissulaire. Elle ouvre alors des perspectives nouvelles pourl'interprétation physiopathologique des lésions et leur prévention.

VERT D'INDOCYANINE (ICG) ET FLUORESCÉINE SODIQUE

Trois facteurs limitent l'intérêt de l'angiographie à la fluorescéine pour l'étudede la vascularisation choroïdienne : d'abord la mélanine de l'épithéliumpigmentaire et le pigment choroïdien qui absorbent et diffusent en grande partie tant lalumière excitatrice que le rayonnement émis de la fluorescence, ensuite le pigmentxanthophylle de la région fovéolaire qui absorbe la plus grande partie du rayonnementbleu de la lumière excitatrice et est en conséquence responsable de l'aspect noir de larégion fovéolaire sur les clichés, enfin le faible confinement intra vasculaire desmolécules de fluorescéine qui ne sont pas liées aux protéines sériques, cesmolécules diffusent dans le milieu extra vasculaire et sont responsables d'unefluorescence de fond qui donne un aspect bruité masquant les vaisseaux choroïdiens sousjacents [23].

L'utilisation du vert d'indocyanine pour l'imagerie de la vascularisation choroïdienneen pratique clinique quotidienne est relativement récente [3], [84], [85]. La sémiologie des imagesd'angiographie infrarouge est d'abord apparue déroutante en raison des différencesqu'elle présente par rapport à la sémiologie de l'angiographie à la fluorescéine. Ilest vrai que comparée à la fluorescéine, l'ICG présente d'abord une structuremoléculaire très différente et donc des propriétés physico-chimiques différentes [86]. La fluorescéine possèdeune masse moléculaire plus petite et un faible coefficient de partage (peu lipophile) tableau III. L'ICG, dontla masse est environ deux fois plus importante que celle de la fluorescéine est de naturetrès amphiphile, c'est-à-dire qu'elle présente des affinités à la fois pour lesmilieux hydrophiles et lipophiles. Le rendement de fluorescence de la fluorescéine estenviron 25 fois supérieur à celui de l'ICG [87]. Les deux moléculesprésentent une extinction de la fluorescence dépendant de leur concentration figure 11. Par contre,dans le cas de la fluorescéine, l'émission de fluorescence a lieu dans le spectrevisible pour lequel une grande proportion est absorbée par l'épithélium pigmentaire [84].

Le passage trans-membranaire de ces molécules est beaucoup plus documenté pour lafluorescéine que pour l'ICG. Outre la spécificité du spectre de l'ICG qui faitl'originalité et l'intérêt de l'angiographie au vert d'indocyanine en complément del'angiographie, l'effet de premier passage hépatique, la taille, la fixation auxprotéines de la molécule d'ICG conditionnent l'aspect des images, surtout aux tempsprécoces. Pour Flower, l'ICG délimite mieux le réseau artériel choroïdien et montrebien mieux la dynamique circulatoire artérielle choroïdienne aux temps précoces enraison de ses particularités [23],[88]. Cette notion pourraitfaire à elle seule tout l'intérêt de l'angiographie ICG dynamique [89], [90]. Dans une étude récente,certains auteurs ont montré que des retards de perfusion choroïdienne de la régionmaculaire aux stades précoces de la DMLA étaient plus souvent mis en évidence avecl'angiographie ICG qu'avec l'angiographie à la fluorescéine [91]. Par contre, comme nousl'avons exposé plus haut, la fluorescéine reste le colorant permettant l'imagerie desaltérations des barrières hémato rétiniennes.

CONCLUSION

Depuis la publication princeps de Novotny et Alvis en 1960, la description de lasémiologie angiographique a très rapidement suivi l'utilisation de la fluorescéine enophtalmologie [18], [19]. Cette sémiologie a permisde réaliser de nombreux progrès pour le traitement des pathologies de rétine médicale.C'est paradoxalement la numérisation avec son corollaire qui est la réalisation d'imagesen fluorescence infrarouge avec le vert d'indocyanine qui a amené un certain nombre dequestions concernant la fluorescence, la diffusion et l'affinité des colorantsfluorescents utilisés pour l'angiographie en ophtalmologie. Une meilleure connaissancedes propriétés fondamentales de ces fluorophores permettra alors de mieux comprendre lesphénomènes de rendement de fluorescence, d'interaction de la fluorescéine avec sonmicro-environnement et de diffusion de la molécule qui conditionnent la sémiologieangiographique de notre pratique quotidienne.

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Tableau I.Caractéristiques de la fluorescéine et de son principal métabolite fluorescent, la fluorescéine monoglucuronide à pH 7,3 d'après Chen, Delori et Grotte [20], [29], [45].

Propriétés physiquesFluorescéineFluorescéine glucuronidePoids moléculaire (dalton)332508Coefficient de partage octanol/eau0,70,04pK6,45Fraction liée à l'albumine humaine0,830,82Coefficient d'absorption molaire (l · mol- 1 · cm- 1)1,6 1059 103Pic d'excitation495450-485Pic d'émission510510Intensité relative de fluorescence (fluorescéine/fluorescéine glucuronide) à 495 ± 2 nm34/1

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Tableau II.Formes prépondérantes de la molécule de fluorescéine en fonction des valeurs de pH. La forme bi-anionique est la forme « hydrophile-libre » dont le pouvoir de fluorescence est élevé. À pH physiologique une certaine proportion de la forme monoanionique est présente. Cette forme est davantage lipophile et peu donc diffuser à travers les membranes phospholipidiques telles que les barrières jonctionnelles (d'après Romanchuk et Martin) [33], [38].

Valeur de pHForme prépondérante de la fluorescéineHydrophilieLipophiliePouvoir de fluorescenceInférieur à 2Forme cationique*****Entre 2 et 4Forme neutre******Entre 4 et 7Forme monoanionique*******Supérieur à 7Forme bi-anionique**********

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Tableau III.Caractéristiques des deux colorants fluorescents utilisés en ophtalmologie (NaF : fluorescéine ; ICG : vert d'indocyanine) d'après Romanchuk et van den Biesen [25], [33], [35].

 Formule chimiquep.m.Solubilité maximale dans l'eauCoef. de partage à pH physiologiqueLiaisonsNaFC10H10O5Na2337> 25 %0,7ProtéinesICGC43H47N2NaO6S2775> 4 %-
  • Protéines
  • Lipoprotéines
  • Phospholipides
       lmax absorptionlmaxémissionRendement de fluorescence (relatif à celui de la fluorescéine)Concentration lors du rendement de fluorescence max (g/l)Temps de décroissance à 50 % de la fluorescence maximaleNaF492518115 minICG8008250,040,0810 min

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Figure 1.Représentation en deux et trois dimensions de la molécule defluorescéine. D'après Dobashi [6].


Figure 2.Spectres d'excitation et d'émission dans les différents solutés.L'écart entre ces 2 spectres permet d'éviter les phénomènes de faussefluorescence en utilisant des filtres interférentiels. D'après Delori [20].


Figure 3.À droite, juxtaposition d'un effet fenêtre et d'un effet masque sur unedéchirure de l'épithélium pigmentaire chez un patient atteint de DMLA. À gauche, DMLAatrophique avec un « faux effet fenêtre » : bien qu'il y ait unealtération de l'épithélium pigmentaire, l'atrophie de la choriocapillaire et d'unegrande partie de la choroïde donne un aspect sombre et non pas une hyperfluorescence(cliché Dr Desmettre).


Figure 4.Rôle de la concentration et du diamètre des vaisseaux pour le rendementde la fluorescence de la fluorescéine : lorsque le diamètre du vaisseau diminue, lerendement de fluorescence augmente en raison d'une moindre absorption par l'hémoglobine.À l'inverse, lorsque la concentration augmente un phénomène d'agrégation desmolécules de fluorescéine intervient et le rendement de la fluorescence diminue. Figurereproduite d'après Pitet [27].


Figure 5.Aspect « laminaire » des veines aux temps précoces del'angiographie à la fluorescéine. On observe un filet fluorescent au centre de la veineréunissant les deux veines de plus petit calibre (flèche). Sur le cliché présenté àdroite, un aspect laminaire peut être observé en angiographie au vert d'indocyanine dontle spectre de fluorescence est situé dans le domaine infrarouge. L'observation d'unaspect laminaire pour ces deux colorants de spectres différents montre que c'est surtoutla différence d'hémodynamique entre le centre et la périphérie des vaisseaux qui està l'origine de l'aspect. (clichés Dr Desmettre).


Figure 6.Variations d'intensité de fluorescence en fonction du pH (excitationoptimale entre 435 nm et 485 nm). D'après le tableau de Pitet [27].


Figure 7.Schéma du métabolisme de la fluorescéine et de son principalmétabolite la fluorescéine glucuronide qui possède des propriétés de fluorescence.D'après Groote [29].


Figure 8.Dommage thermique rétinien mis en évidence par l'angiographie à lafluorescéine : la taille de l'anneau par rapport à la surface du centre peutpermettre de quantifier précisément l'intensité de la photocoagulation (clichéDr Desmettre).


Figure 9.Imagerie d'un dommage cornéen (herpès) à l'aide d'un collyre à lafluorescéine. La fluorescéine imprègne le stroma cornéen à partir d'une zone oùl'épithélium est lésé (Cliché : Dr Pinoche, Boulogne sur Mer).


Figure 10.Image endoscopique enregistrée 10 minutes après l'injection defluorescéine. Les zones d'hyperfluorescence focalisée ont un diamètre de 0,8 mm.Ces zones ne sont pas visibles lors de l'endoscopie en lumière blanche et la muqueuseapparaît normale. L'examen histologique de ces spots révèle une érosion superficiellesurmontant un follicule lymphoïde (Cliché : Dr Maunoury, Service des maladiesde l'appareil digestif, CHU Lille).


Figure 11.Courbes d'extinction de la fluorescence de la fluorescéine et de l'ICGen fonction de leur concentration dans le sang total. Figure reproduite d'aprèsHochheimer [15].



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