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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 25, N° 6  - juin 2002
pp. 590-593
Doi : JFO-06-2002-25-6-0181-5512-101019-ART4
Détection de la contamination fongique des liquides de conservation de cornées
 

A. Rousset [1], R. Piarroux [1], G. Reboux [1], N. Roubi [2], B. Delbosc [3]
[1]  Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU Jean Minjoz, 25030 Besançon.
[2]  Établissement Français du Sang Bourgogne Franche-Comté, 25030 Besançon.
[3]  Clinique d'Ophtalmologie, CHU Jean Minjoz, 25030 Besançon.

Tirés à part : B. Delbosc [3] , à l'adresse ci-dessus.

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Détection de la contamination fongique des liquides de conservation de cornées

But de l'étude : Les champignons peuvent entraîner des complications majeures après une greffe de cornée. L'objectif de ce travail est de s'assurer de l'efficacité d'un protocole de détection des contaminations fongiques des greffons en conservation avant cession pour usage clinique.

Matériels et méthodes : Les 12 espèces de champignons les plus souvent incriminées dans des kératites ou des endophtalmies dues ou non à des greffes de cornées ont chacune été inoculées au milieu de conservation utilisé par la plupart des banques de cornées françaises. Un protocole de surveillance par contrôle visuel quotidien, en vigueur dans plusieurs centres, a été suivi afin de vérifier qu'il conduisait dans tous les cas à la mise en évidence des micro-organismes, notamment des champignons filamenteux à culture lente.

Résultats : Toutes les espèces ont été détectées dans des délais de 2 à 4 jours.

Conclusion : Ce protocole de détection des contaminations microbiologiques des cornées humaines en organoculture à + 31 °C, apparaît efficace pour déceler les principaux agents responsables de contaminations fongiques.

Abstract
Fungal contamination detection in cornea preservation media

Purpose: Fungi can cause major complications following corneal grafting.

In this study we aimed to verify the efficiency of a fungal contamination detection protocol for human corneas in preservation before clinical use.

Materials and methods: The 12 most frequently found species of fungi responsible for keratitis and endophthalmitis were inoculated to preservation medium used by most French eye banks. A protocol used by several centers, including a daily visual control, was followed in order to check that it showed the presence of all microorganisms, particularly slow-growing filamentous fungi.

Results: Every species was detected in a time from 2 to 4 days.

Conclusion: This microbiological contamination detection protocol of detection for human corneas in organ culture at +31°C, seems to effectively detect the main agents responsible for fungal contamination.


Mots clés : Greffe de cornée , contamination fongique , conservation , détection

Keywords: Corneal grafting , fungal contamination , preservation , detection


INTRODUCTION

Les complications infectieuses des greffes de cornées, kératites ou endophtalmies, sont des événements rares mais souvent dramatiques, exposant le receveur à la perte fonctionnelle de l'oeil atteint [1], [2], [3], [4], [5]. Elles sont dans la grande majorité des cas consécutives à une contamination préalable du greffon [4].

Les kératites et endophtalmies post-kératoplasties sont d'origine bactérienne dans 70 à 80 % des cas et fongique dans 20 à 30 % des cas, Candida albicans étant la principale espèce de champignon incriminée [3], [4].

La surveillance du statut microbiologique des greffons humains fait partie intégrante de la greffe de cornées et des mesures rigoureuses doivent être appliquées afin d'éviter à tout prix cette éventualité. En outre, les textes législatifs et réglementaires imposent une garantie de stérilité [6]dans le cadre de la greffe de cornées.

La prévention des complications infectieuses post-chirurgicales comprend une phase de décontamination des globes oculaires du donneur par une solution antiseptique et du sérum physiologique, et une phase de détection des contaminations éventuelles.

Cette seconde phase s'avère difficile lorsqu'il s'agit de contaminants fongiques [7], [8]. Chu et al. ont observé dans une étude récente portant sur plusieurs espèces bactériennes et Candida albicans , que ce champignon se révélait particulièrement délicat à détecter [8].

Les protocoles en vigueur au sein de la plupart des Banques de cornées françaises consistent en une conservation en milieu de culture cellulaire enrichi en flacons fermés à +31 °C [9], [10], [11], [12].

La préparation des milieux inclut l'ajout d'antibiotiques et d'antifongiques.

Le milieu Inosol (Laboratoire Opsia ® , Toulouse, France) contient de la pénicilline G (100 UI/ml) et de la streptomycine (100 mg/ml). En revanche, l'amphotéricine B introduite en début de fabrication n'est pas retrouvée sur le produit fini et ne peut donc assurer une couverture antifongique pendant la conservation (Frayret MN, Luc J, Michel G. Activité fongicide comparée de l'amphotéricine B en présence et en absence du milieu de base Inosol sur Candida albicans ).

Ce milieu est utilisé à la Banque de cornées de Besançon et la détection d'une contamination fongique repose sur un dépistage visuel quotidien.

Le but de notre travail est de vérifier et de valider le protocole utilisé, en s'assurant de son efficacité vis-à-vis des champignons les plus fréquemment responsables de kératites et d'endophtalmies consécutives ou non à une greffe de cornée, et ceci dans un délai inférieur à la durée minimale de conservation des greffons.

MATÉRIELS ET MÉTHODES
Procédure de contrôle à évaluer

Les protocoles de surveillance de la contamination microbiologique retenus par la plupart des Banques de cornées françaises incluent une période de conservation minimale de 6 à 14 jours au sein du milieu précédemment cité, en étuve sèche à + 31 °C [12].

À la Banque de cornées de Besançon, un contrôle visuel quotidien est effectué au cours d'une période minimale de 10 jours afin de repérer l'apparition éventuelle d'un trouble ou d'un changement de couleur du milieu. En cas de suspicion d'infection lors de cette période, le milieu est acheminé au laboratoire de microbiologie pour identification du contaminant sur milieu de Sabouraud à 31 °C.

Un liquide de conservation limpide et de couleur constante au terme du délai de conservation, est analysé au laboratoire avant que la cornée soit délivrée pour usage clinique.

Espèces fongiques étudiées

Il s'agit des champignons principalement incriminées dans les endophtalmies et les kératites fongiques suivant ou non une kératoplastie, ou des espèces les plus souvent responsables de contaminations des liquides de conservation. Ces micro-organismes sont mentionnés dans le tableau Iet ont été choisis d'après les données de la littérature [1], [2], [3], [4], [5] [13], [14], [15], [16]et notre expérience personnelle.

Préparation des souches

Elles ont été obtenues en culture pure sur milieu de Sabouraud (AES Laboratoire ® , Combourg, France). Celles-ci provenaient de la collection du laboratoire de Parasitologie-Mycologie du Centre Hospitalier Universitaire de Besançon.

Un contrôle de pureté, par des observations macroscopiques et microscopiques si nécessaire, a été réalisé.

L'identification de l'espèce (ou du genre pour Absidia, Acremonium , Cryptococcus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma ) a été confirmée avant inoculation par

  • un examen direct microscopique ainsi qu'une galerie ID 32 C (Laboratoire Biomérieux ® , Marcy-l'Étoile, France) pour chaque espèce de levure ;
  • un examen microscopique des champignons filamenteux, en utilisant au besoin des milieux favorisant leur fructification : eau gélosée 2 % (Pastagar B, Sanofi Diagnostics Pasteur ® , Marnes-la-Coquette, France), milieu au malt 3 % (Oxoid, Unipath ® , Basingstoke, England).

Évaluation de la quantité minimale d'éléments fongiques (levures ou spores) à inoculer au milieu pour vérifier l'efficacité du protocole de surveillance

On a considéré que cette quantité correspondait à la quantité minimale de levures (espèce-test : Candida albicans ) ou de spores (espèce-test : Aspergillus fumigatus ) nécessaires pour entraîner une croissance fongique dans le milieu de conservation de cornées.

Pour chacune des deux espèces, trois suspensions dans du sérum physiologique ont été préparées à l'aide d'une cellule de Malassez : 10, 50 et 100 éléments par ml.

L'ensemencement de trois fois 3 ml de milieu de conservation de cornées avec 1 ml de chaque suspension a été réalisé. On a ainsi inoculé respectivement 10, 50 et 100 éléments pour un volume total de 4 ml.

Les tubes ont ensuite été incubés à 31 °C, puis observés quotidiennement jusqu'à détection d'un trouble.

Lorsque celui-ci est apparu, un milieu de Sabouraud a été ensemencé et observé à 24 h et 48 h.

L'identification des champignons a été réalisée comme précédemment, afin de s'assurer qu'il s'agissait bien de Candida albicans ou d' Aspergillus fumigatus .

Les dilutions de Candida albicans ont toutes conduit à une croissance au sein du liquide de conservation, en deux jours, provoquant le virage de la couleur du milieu (de rose à jaune).

Les milieux de Sabouraud ensemencés à partir des tubes ont permis la croissance de Candida albicans en deux jours.

La plus faible quantité de levures (10 levures par tube, contenant 3 ml de liquide de conservation de cornées et 1 ml d'eau physiologique) correspond par conséquent à la quantité qui a été introduite pour les autres espèces de champignons levuriformes.

Les dilutions de spores d' Aspergillus fumigatus ont également toutes entraîné un développement fongique dans le liquide de conservation de cornées, en 2 jours et les milieux de Sabouraud ensemencés ont permis l'isolement d' Aspergillus fumigatus en 2 jours.

Par conséquent, là encore, la plus faible quantité de spores (10 spores par tube, contenant 3 ml de liquide de conservation de cornées et 1 ml d'eau physiologique) a été inoculée pour les autres espèces de champignons filamenteux.

Évaluation de l'efficacité du protocole pour la détection des 12 espèces fongiques

La même méthodologie a été reprise pour chaque champignon, en inoculant au milieu de conservation de cornées, 10 éléments fongiques, levures ou spores.

Les milieux ont été incubés en étuve sèche à + 31 °C et l'apparition éventuelle d'un trouble au sein des tubes a été surveillée quotidiennement.

Un milieu de Sabouraud a été ensemencé lorsqu'un trouble a été détecté et le champignon a été identifié.

Un témoin négatif a été réalisé avec 3 ml de milieu de conservation de cornées et 1 ml de sérum physiologique stérile ; cette solution a été observée quotidiennement durant la période expérimentale.

Validation des résultats obtenus en tubes

Puis il a été nécessaire de s'assurer de la légitimité de l'extrapolation des résultats obtenus en tubes à la situation réelle, les cornées étant conservées en flacons de 100 ml.

Les expérimentations ont donc été répétées en flacons de liquides de conservation de cornées de 100 ml ; 1 ml de sérum physiologique contenant ces spores ou ces levures a ainsi été ajouté à 100 ml de milieu de conservation de cornées. Cette manipulation a été effectuée pour une levure ( Candida albicans ) et un champignon filamenteux ( Aspergillus fumigatus ).

RÉSULTATS
Évaluation en tubes de l'efficacité du protocole pour la détection des 12 espèces étudiées

Le témoin négatif réalisé est resté rose et limpide durant toute la période d'observation.

Le tableau IIprésente les délais nécessaires à la détection visuelle d'une croissance fongique et au développement des champignons sur les milieux de Sabouraud ensemencés à partir de ces tubes.

Validation des résultats obtenus en tubes

Les délais nécessaires à la détection d'un trouble visuel et au virage de la couleur du milieu en flacons sont également figurés dans le tableau II.

DISCUSSION

Tous les champignons inoculés sont retrouvés par la procédure de contrôle utilisée, ce qui confirme que l'amphotéricine B est dénaturée au sein du produit fini.

De surcroît, les résultats de cette étude montrent que le délai de détection des contaminants fongiques testés est au maximum de 4 jours, pour Penicillium sp et Trichoderma sp .

Ainsi, ce travail valide a posteriori ce protocole de surveillance de la contamination fongique des cornées en conservation. Ceci confirme notre expérience clinique, aucune endophtalmie post-kératoplastie transfixiante n'ayant été signalée par les centres greffeurs sur plus de 800 transplantations depuis 1986.

La durée minimale de quarantaine de 6 jours en vigueur dans certaines banques de cornées est donc théoriquement suffisante quant à la détection des contaminations fongiques, même si la plupart des centres français ont opté pour des délais d'immobilisation supérieurs, de 6 à 14 jours [12].

Pour notre part, nous avons décidé de maintenir le délai de quarantaine de 10 jours. Cependant aucune mesure ne peut être absolument efficace car certaines infections peuvent se déclarer au delà de cette limite.

Il s'agit alors soit de germes à croissance extrêmement lente, soit de germes initialement situés à l'intérieur du tissu cornéen s'y développant avant d'envahir tardivement le milieu de culture.

Afin de réduire la contamination fongique pendant la conservation, une modification du milieu de culture pourrait être proposée. Celle-ci consisterait soit en l'ajout au sein du produit fini d'amphotéricine B ou de nystatine (antifongiques les plus utilisés en Europe), soit en certains changements du procédé de fabrication permettant à l'amphotéricine B d'être retrouvée à l'issue de la préparation.

Cependant, dans notre expérience, si le taux de contamination microbiologique des cornées mises en culture, durant la période de 1994 à 1999, a été de 12,6 % (144/1144), les contaminations fongiques n'ont affecté que 2,53 % des greffons (29/1144).

Le gain théorique maximal aurait donc représenté 29 cornées sur une période de 6 ans, avec néanmoins un risque potentiel de masquer une éventuelle contamination en retardant la croissance d'un champignon sans le détruire, celui-ci pouvant conduire à des complications gravissimes.

En outre, ces cornées auraient pu s'avérer non conformes pour d'autres raisons.

Par conséquent, rien ne justifie, à notre avis, pour ce qui est du risque fongique, la modification du protocole actuel.

Références

[1]
Larsen PA, Lindstrom RL, Doughman DJ. Torulopsis glabrata endophthalmitis after keratoplasty with an organ cultured cornea. Arch Ophthalmol, 1978;96:1019-22.
[2]
Rao GN, Aquavella JV. Cephalosporium keratitis following penetrating keratoplasty. Ophthalmic Surg, 1979;10:34-7.
[3]
Harris Jr DJ, Stulting RD, Waring III GO, Wilson LA. Late bacterial and fungal keratitis after corneal transplantation. Spectrum of pathogens, graft survival, and visual prognosis. Ophthalmology, 1988;95:1450-7.
[4]
Kloess PM, Stulting RD, Waring III GO, Wilson LA. Bacterial and fungal endophthalmitis after penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol, 1993;115:309-16.
[5]
Tanure MAG, Cohen EJ, Sudesh S, Rapuano CJ, Laibson PR. Spectrum of fungal keratitis at Wills Eye Hospital, Philadelphia, Pennsylvania. Cornea, 2000;19:307-12.
[6]
Arrêté du 24 juillet 1992 complétant ou modifiant le tarif interministériel des prestations sanitaires. Journal Officiel de la République Française, 8 septembre 1992, 12303-7.
[7]
Jendral G, Wilhelm F, Bernhardt H, Eichler P, Kietzmann G. Schwierigkeiten beim Pilznachweis in Hornhautkulturmedium. Ophthalmologue, 1999;96:465-7.
[8]
Chu YI, Penland RL, Wilhelmus KR. Colorimetric indicators of microbial contamination in corneal preservation medium. Cornea, 2000;19:517-20.
[9]
Laroche L, Borderie V, Lopez M, Saraux H. Sécurité microbiologique et contrôle de qualité endothéliale au cours de la conservation des greffons cornéens à + 31 °C. J Fr Ophtalmol, 1994 ;17 :314-20.
Erbezci M, Monnot PH, Michel-Briand Y, Masse M, Delbosc B. Conservation en culture d'organes à +31 °C de la cornée humaine et risque infectieux. J Fr Ophtalmol, 1995 ;18 :106-13.
Delbosc B, Borderie V. Méthodes de conservation des cornées humaines. J Fr Ophtalmol, 1997 ; 20 :221-40.
Annuaire des Centres Français de Conservation de Cornées, 1999. Faculté de Médecine et de Pharmacie, Besançon, 2000, 182 p.
Beyt Jr BE, Waltman SR. Cryptococcal endophthalmitis after corneal transplantation. N Engl J Med, 1978;298:825-6.
Behrens-Baumann W, Ruechel R, Zimmermann O, Vogel M. Candida tropicalis endophthalmitis following penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol, 1991;75:565.
Kremer I, Goldenfeld M, Shmueli D. Fungal keratitis associated with contact lens after penetrating keratoplasty. Ann Ophthalmol, 1991;23:342-5.
Colin J, Mehou-Loko A, Le Flohic AM. Kératites amibiennes et kératites fongiques. In : Ophtalmologie. Paris : Encycl Méd Chir, 1995. 21-200-D-25.
Définitions

ABRÉVIATIONS
°Cdegré Celsius
hheure
mlmillilitre
mgmicrogramme
mlmicrolitre
UIunité internationale




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