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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 26, N° 5  - mai 2003
pp. 439-452
Doi : JFO-05-2003-26-5-0181-5512-101019-ART1
Anneau capsulaire non biodégradable relargant pour la prévention de la cataracte secondaire
Partie II : Évaluation in vivo
 

B. Cochener [1], S. Pandey [2], D. Apple [2], R. Bougaran [3], J. Colin [4]
[1]  Service d'Ophtalmologie, CHU Morvan, 5, avenue Foch, 29609 Brest, France.
[2]  Department of Anatomopathology, University of Charleston, Carolina, USA.
[3]  Laboratoire Corneal, Annecy, France.
[4]  Service d'Ophtalmologie, CHU Pellegrin, Bordeaux, France.

Travail présenté en communication orale (SFO 1998, Accommodation Clud 1998, ASCRS 1999, ESCRS 2000).

Résultats de l'étude histologique accepté pour publication dans le J Cataract Refract Surg (mars 2001).

La première partie de l'article a été publiée dans le J. Fr. Ophtalmol, 2003; 26: 223-31.


Tirés à part : B. Cochener [4]

[5]  , à l'adresse ci-dessus. E-mail :

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Anneau capsulaire non biodégradable relargant pour la prévention de la cataracte secondaire

But de l'étude : La cataracte secondaire représente la plus fréquente complication de la chirurgie de la cataracte depuis l'avènement de la phacoémulsification. Sa prévention constitue aujourd'hui un des essentiels défis de la recherche en ophtalmologie. Nous avons développé un anneau de tension intrasaculaire libérateur d'antimitotique (5 Fluorouracile : 5-FU) visant cet objectif par la combinaison de propriétés mécaniques et pharmacologiques, capable d'interférer sur la cascade de réactions des cellules épithéliales cristalliniennes résiduelles incriminées dans le processus. Nous présentons les résultats de la phase d'évaluation animale destinée à déterminer l'efficacité et la sécurité de l'anneau relargant.

Matériel et Méthodes : La mise au point in vitro d'un dispositif relargant en accord avec le cahier des charges fut la première étape fondamentale du travail, préliminaire à l'approche in vivo animale. Après une étude pilote de faisabilité réalisée chez le microporc, 22 lapins femelles albinos ont subit une phacoexcérèse de leur oeil droit. Quatre groupes ont été constitués : le groupe 1 (6 animaux) servant de témoin n'a bénéficié que d'un retrait du cristallin, le groupe 2 (6 animaux) étant implanté dans le même temps d'un anneau de tension capsulaire non relargant et le groupe 3 (6 animaux) recevant également un anneau, mais libérateur d'antimitotique. Le groupe 4 (4 animaux) implantés d'anneaux libérateurs de 5-FU fut réservé à des prélèvements étagés d'humeur aqueuse destinés à la détermination de la cinétique de libération du principe actif.

Résultats : L'évaluation clinique en biomicroscopie et l'analyse histologique révèlent une moindre réaction de cataracte secondaire dans les yeux porteurs d'un anneau. En comparaison au groupe 1, l'opacification capsulaire postérieure centrale apparaît significativement inférieure en densité et en étendue dans les groupes 2 et 3. Aucune toxicité intra-oculaire n'a été mise en évidence. L'étude de pharmacocinétique s'est heurtée à un manque de sensibilité de la méthode de détection du principe actif (par chromatographie haute performance).

Discussion-Conclusions : L'observation d'une réaction de cataracte secondaire amoindrie par la présence d'un anneau capsulaire démontre l'intérêt du rôle mécanique de ce dernier. Si le bénéfice d'une action pharmacologique additive apportée par la libération de 5-FU n'a pu être prouvé, le concept théorique de support relargant paraît séduisant et invite à l'évaluation d'autres agents modulateurs potentiels du comportement cellulaire.

Abstract
Nonbiodegradable drug-sustained capsular ring for prevention of secondary cataract. Part II: In vivo evaluation

Purpose: The appearance of a secondary cataract constitutes the most common complication of cataract surgery since the advent of phacoemulsification. Prevention is today one of the crucial challenges of research in ophthalmology. We have developed a drug-sustained capsular ring releasing 5-fluorouracil (5-FU). This system targets the goal of combining advantageous mechanical and pharmacological properties with the ability to interfere on the epithelial cellular processes of secondary cataract. This paper presents the results of animal evaluation.

Material and Methods: The study first developed the in vitro delivery system as a preliminary step to the animal in vivo approach. After a pilot study conducted on micro pigs, lens extraction was performed on the right eye of 22 female albino rabbits. The four study groups included: group 1 (6 animals) as a control group receiving only phacoemulsification; group 2 (6 animals) receiving phacoemulsification and the implantation of a nonsustained capsular tension ring; and group 3 (6 animals) receiving a drug-sustained ring. Group 4 (4 animals), implanted with a 5-FU-sustained ring, was reserved for staged samples of aqueous humor for kinetic determination of active agent release.

Results: Clinical evaluation based on biomicroscopy and histology showed a lesser reaction of secondary cataract in eyes with the ring. Compared to group 1, central posterior capsular opacification appeared significantly lower in density and surface in groups 2 and 3. No intraocular toxicity was observed. The poor sensitivity of the 5-FU detection method (high-performance chromatography) impaired pharmacokinetic evaluation.

Discussion-Conclusions: The decrease in secondary cataract reaction in cases of implanted capsular ring demonstrated the advantages of its mechanical effect. However, the benefit of an additive pharmacological action related to the release of 5-FU could not be proved. Nevertheless, the theoretical concept of a drug-sustained delivery system seems attractive and thus calls for evaluation of other potential modulators of cell behavior.


Mots clés : Cataracte secondaire , opacification capsulaire postérieure , anneau capsulaire , système à libération contrôlée prolongée

Keywords: Secondary cataract , posterior capsular opacification , capsular tension ring , drug-sustained delivery system


L'opacification capsulaire postérieure représente la complication majeure de la chirurgie de la cataracte, qui a atteint un très haut niveau de succès depuis l'avènement de la phacoémulsification [1]. La survenue de la cataracte secondaire concernerait 20 % des patients à 1 an et 50 % à 5 ans, requièrant une capsulotomie au laser YAG, qui à cette heure constitue le seul traitement disponible mais n'est pas dénué de risques et fait l'objet d'un lourd surcoût [2]. Ces implications médicales et économiques font de ce phénomène un enjeu de santé publique, qui place une des priorités de la recherche en ophtalmologie dans la prévention de la cataracte secondaire.

Nous avons développé un anneau intracapsulaire constitué d'un copolymère non biodégradable réunissant des propriétés mécaniques de tension à des capacités de libération d'un principe actif pour une action potentiellement antiproliférative sur les cellules épithéliales. La phase d'évaluation in vitro , dont la synthèse fait l'objet de la première partie de ce travail, a abouti à l'ajustage du biomatériau adéquat et à la vérification de ses caractéristiques mécaniques et pharmacologiques. Les conclusions favorables de cette approche autorisent à engager l'étape d'évaluation chez l'animal. En premier lieu, le microporc fut l'espèce retenue avec la seule prétention d'une étude de faisabilité préliminaire à l'étude plus conventionnelle réalisée chez le lapin.

ÉTUDE PILOTE CHEZ LE MICROPORC DU YUCATAN
Matériel et méthodes
Microporc du Yucatan

Cet animal est issu de l'hybridation obtenue en laboratoire (Charles River France) d'une espèce particulière de miniporcs provenant de la province du Yucatan (Mexique). L'animal qui en dérive est qualifié de microporc en raison de sa petite taille (environ 12 kg). Il se caractérise par sa docilité, qui facilite son approche et surtout par ses analogies avec l'espèce humaine concernant notamment l'anatomie oculaire. C'est cette propriété exceptionnelle qui nous a conduit à recourir à ce modèle animal pour vérifier la possible implantation de notre anneau.

Quatre microporcs ont ainsi subi au niveau de leurs deux yeux une ablation du cristallin par phacoémulsification : les yeux droits non implantés étaient destinés à évaluer surtout l'importance du traumatisme chirurgical, alors que tous les yeux gauches devaient recevoir un anneau porteur ou non de 5-FU. La chirurgie fut pratiquée dans les conditions d'asepsie et d'équipement identiques à celles imposées en chirurgie humaine.

Anneau intracapsulaire HPMA-MMA prototype

Préalablement à la chirurgie, un recueil d'yeux congelés sectionnés nous a permis de définir les mensurations moyennes de l'oeil du microporc dans le but d'ajuster un anneau spécifique pour l'expérimentation (fig. 1). Le sac capsulaire s'est ainsi révélé d'une profondeur d'environ 3 à 4 mm et d'un diamètre moyen de 13 mm. Des anneaux ont alors été fabriqués aux dimensions adaptées ; à savoir : un diamètre de 12,52 mm, une épaisseur constante de 0,4 mm, des bords carrés et une masse moyenne de 13,80 mg. Ils ont été polis et stérilisés. Une partie d'entre eux fut chargée en 5-FU selon la méthode employée précédemment. La quantité chargée est de 0,35 mg.

Protocole opératoire et suivi

Les animaux sont systématiquement accueillis au minimum 8 jours avant la chirurgie afin de les familiariser avec les locaux de stabulation et de veiller ainsi à ne pas majorer le stress relatif à l'opération. Ils sont laissés à jeun la veille de la chirurgie pour permettre l'anesthésie générale. L'alimentation ne sera reprise que 12 heures après l'intervention.

L'endormissement est préparé par une prémédication d'atropine 1 %, injectée en intraveineuse directe (au niveau de l'oreille) 15 minutes avant le geste opératoire. L'induction est obtenue par une injection intramusculaire d'une combinaison de : kétamine (Kétalar ® , 25 mg/kg) et xylazine (Rompum ® , 5 mg/kg). L'anesthésie générale est entretenue, après intubation, par un mélange gazeux de fluothane et oxygène en circuit ouvert. Il est à noter, qu'un soin particulier doit être apporté à l'installation des microporcs, dont la peau sensible s'escarrifie rapidement si elle repose sur une surface irrégulière. Les animaux sont donc mis en place sur un champ dépourvu de plis et recouvrant une plaque chauffante régulièrement contrôlée.

Par ailleurs, afin de garantir une mydriase peropératoire, nécessaire à la bonne visualisation du cristallin, des instillations répétées de tropicamide 1 % (6X à 5 min d'intervalle), néosynéphrine 10 % (3X) et atropine 1 % (3X) sont entamées dans l'heure qui précéde le geste.

Dans tous les cas, l'opération a consisté en premier lieu en une phacoexcérèse réalisée à l'aide d'une machine de modèle « Universal » (Alcon). Après rasage de la région périorbitaire et soigneux lavage bétadiné des paupières et culs de sac palpébraux sont mis en place un champ opératoire autocollant avec poche de recueil intégrée, puis un blépharostat souple de type « colibri » permettant une ouverture sans tension des paupières. La chirurgie est abordée par une ouverture de 3,2 mm pratiquée en cornée claire limbique temporale ; la sclère particulièrement rigide et pigmentée rendant la réalisation d'un tunnel scléral impossible. Cette incision est associée à la création d'un orifice de paracenthèse. Un agent viscoélastique dispersif est injecté, destiné au remplissage de la chambre antérieure (0,2 à 0,4 cc compte-tenu du volume important de cet espace dans le cas du microporc), au maintien des volumes et surtout à la protection de l'endothélium cornéen. Une capsulotomie antérieure est alors découpée à l'aide d'un cystitome (à usage unique, Alcon) sous la forme d'un capsulorhexis continu circulaire d'un diamètre moyen de 5 mm. Nous apprécions l'élasticité particulière de cette capsule antérieure, qui rend aisé et reproductible la capsulotomie. La phacoémulsification à proprement parler peut être réalisée après hydrodissection du noyau cristallinien. En règle générale, étant donné la transparence du cristallin jeune, un courant d'irrigation-aspiration suffit à obtenir l'élimination du noyau et des masses corticales, sans nécessité d'ultra-sons. Un soin tout particulier est apporté au lavage du sac et surtout de l'auvent capsulaire antérieure au terme de la phacoexcérèse, dans le souci de minimiser le nombre de cellules épithéliales résiduelles. Une nouvelle injection de produit visqueux permettra l'implantation de l'anneau de tension capsulaire au niveau des yeux gauches. La chambre antérieure est rincée finalement de ce viscoélastique et la porte d'entrée est refermée par une suture en croix de monofilament nylon 10/0, dont le noeud est enfoui en conjonctive. La solution d'irrigation utilisée (Ringer ® ) contient de l'héparine, destinée à minimiser la réaction inflammatoire postopératoire.

Le geste se termine par une injection sous-conjonctivale d'une combinaison antibiotique et antiinflammatoire (gentalline — célestène), suivie de l'application d'une pommade corticoïde. Le traitement postopératoire associe : un collyre mydriatique (tropicamide 1 %, 3X par jour pour 1 semaine) à une combinaison antibiotique et stéroïde (néomycine-dexaméthasone 3X par jour pour 2 semaines).

L'évaluation postopératoire a été réalisée par des contrôles biomicroscopiques avec prises de clichés photographiques, effectués aux différents temps suivants : J1, J3, J7, J21, J28, 6 et 8 semaines.

Au terme de ces deux mois de suivi, les animaux sont alors sacrifiés par une injection intraveineuse ou intracardiaque d'une solution vétérinaire spécifique (Eutha 6 ® ). Bien entendu, il est prévu de pratiquer une euthanasie plus précoce en cas de souffrance irréductible inductrice d'une altération de l'état général.

Résultats et discussion
Complications

Tous les animaux ont parfaitement toléré l'anesthésie générale et n'ont donc présenté aucune difficulté ni à l'endormissement ni au réveil.

Si la phacoexcérèse s'est déroulée dans tous les cas aisément et sans complication (en particulier, préservation de la capsule postérieure), la mise en place d'un anneau sacculaire au niveau des yeux gauches s'est avérée beaucoup plus délicate, concernant les dispositifs recouverts de 5-FU. En effet, la rigidité de ces derniers les rendait très peu flexibles et même particulièrement fragiles puisque chaque tentative d'implantation a conduit à une cassure des anneaux et à une nécessité d'explanter les fragments. Finalement, seuls des anneaux dépourvus de principe actif ont pu être introduits dans le sac.

Dans ces conditions, il n'est pas surprenant de rapporter un oedème de cornée en postopératoire immédiat, sur un oeil probablement traumatisé par une chirurgie prolongée avec deux implantions successives.

À une semaine de distance de la chirurgie, un autre oedème irréductible est apparu sur un oeil gauche présentant une luxation de l'implant en chambre antérieure. Enfin, une troisième décompensation oedémateuse s'est installée sur un oeil droit aphake, mais ayant souffert d'une étanchéité incomplète des sutures, entraînant, par diminution du volume de la chambre antérieure, un possible contact entre endothélium cornéen et sac capsulaire.

Observations cliniques (biomicroscopiques)

Comme, nous l'avons précédemment mentionné, 3 oedèmes de cornée diffus irréductibles représentent les seules complications oculaires. Ils ont abouti à une cornée opaque, masquant les structures du segment antérieur et donc empêchant d'observer d'éventuelles synéchies (adhérences inflammatoires) et d'évaluer la position de l'anneau si présent.

Le profil évolutif habituel observé à la lampe à fente apparaît constitué de 3 phases : durant la première semaine, existence en regard de l'incision d'un oedème cornéen de résorption progressive associé à une hyperémie conjonctivale et à une dispersion de cellules inflammatoires et hématiques en chambre antérieure (effet Tyndall 1 à 3+) ; puis apparition de fibrine autour de l'implant et de l'iris, accompagnant une réaction cellulaire difficile à quantifier ; enfin, aux alentours du second mois, éclaircissement du segment antérieur laissant persister une fibrose variable sous la forme de synéchies entre iris, capsules, voire cornée. Selon cette évaluation qualitative, il semblerait que les yeux implantés d'anneaux présenteraient moins de cataracte secondaire.

Remarques et discussion

Compte-tenu de la trop petite série considérée, ces résultats sont totalement insuffisants pour conclure sur l'efficacité du dispositif ; d'autant plus qu'aucun anneau avec 5-FU n'a pu être implanté.

Toutefois cette évaluation constitue véritablement une étude pilote, dont l'intérêt essentiel aura été de nous révéler une fragilité inattendue des anneaux revêtus, non prévisibles par l'approche in vitro . Nous avons alors constaté que le mode de conditionnement avait son importance puisque les anneaux préparés sous dessicant dans un sachet d'aluminium étaient fragiles et cassaient systématiquement lors de l'implantation. Ce procédé de préparation avait été choisi dans le but d'éviter la dégradation du poly lactide-co-glycolide par l'air ambiant (principalement l'humidité). En revanche, les dispositifs exposés à une atmosphère stérile quelques jours, comme ce fut le cas pour les anneaux sans 5-FU, semblent implantables sans difficulté. Nous avons ainsi été conduits à modifier le mode de conditionnement en adoptant une préparation à sec.

À titre annexe, cette étude nous a permis de valider le microporc comme modèle animal potentiel pour la recherche en ophtalmologie. Les caractéristiques anatomiques de son oeil permettent de réaliser des chirurgies dans des conditions proches de celles pratiquées chez l'homme. Toutefois, il est à noter que sa cornée paraît particulièrement fragile et sensible au contact et que son taux de pigmentation important pourrait expliquer une réponse inflammatoire fibreuse dense. Finalement, en terme de taille, de docilité et de coût, cet animal pourrait se situer entre le lapin (loin de l'oeil humain, mais autorisant les larges séries) et le singe (le modèle idéal reconnu, mais ne pouvant être réservé qu'à des études limitées et ciblées de par son coût et son approche difficile).

ÉTUDE CHEZ LE LAPIN DE L'ANNEAU INTRACAPSULAIRE HPMA-MMA

Après avoir montré la faisabilité d'un anneau relargant du 5-FU sur une période de quelques jours in vitro , un anneau a pu être dessiné, adapté à la capsule cristallinienne du lapin choisi comme modèle de référence en matière de cataracte, en raison de son aptitude à produire après extraction du cristallin une réaction de cataracte secondaire exubérante dans sa rapidité et son intensité, avec régénération du cristallin [3].

Les objectifs du travail visent à vérifier l'efficacité de ce système à libération prolongée sur la cataracte secondaire, à évaluer l'action de l'antimitotique ainsi délivré sur la PCO mais surtout sur la toxicité oculaire et de contrôler la mise en tension du sac capsulaire (fig. 2).

Matériel et méthodes
Répartition des animaux

Dans des conditions également de chirurgie humaine sur le plan de l'asepsie et de l'équipement, 22 femelles de variété albinos (de 6 mois et d'environ 2,5 kg) ont été opérées uniquement de leur oeil droit d'une extraction de cristallin par phacoémulsification éventuellement suivie de la mise en place d'un anneau intrasacculaire porteur ou non de 5-FU. L'oeil gauche fut laissé indemne en accord avec les recommandations vétérinaires de la recherche animale et dans le souci d'éviter le risque de mutilation et de réaction sympathique d'une chirurgie bilatérale.

Quatre groupes de lapins ont été constitués

  • groupe 1 : 6 animaux ne subissant qu'une phacoexcérèse sans implantation d'anneau ;
  • groupe 2 : 6 lapins bénéficiant d'une phacoémulsification et de la mise en place d'un anneau sans 5-FU ;
  • groupe 3 : 6 lapins opérés de la même chirurgie et recevant un anneau porteur de 5-FU ;
  • groupe 4 : 4 lapins traités conformément au groupe 3, mais destinés à un suivi particulier fait de prélèvements étagés d'humeur aqueuse et à des observations des anneaux in situ.

Le modèle d'anneau implanté correspond à celui décrit à l'issue de l'étude in vitro (cf. partie I). Pour s'ajuster de façon optimale au sac capsulaire, l'anneau intracapsulaire a été dessiné avec les mensurations suivantes : un diamètre de 10 mm, une largeur de 1 mm, une épaisseur de 0,2 mm et une forme circulaire ouverte permettant une introduction aisée et surtout permettant le rapprochement voire le chevauchement des deux extrémités après réexpansion du matériau dans le milieu biologique. L'hypothèse de libération de 5-FU retenue se basait sur le schéma de relargage établi in vitro .

Protocole opératoire

Le schéma opératoire est globalement superposable à celui adopté pour les microporcs. Aussi ne seront soulignées que les particularités du protocole relatives au modèle du lapin.

L'anesthésie générale fait appel aux mêmes agents médicamenteux, mais recourt à la ventilation au masque, étant donné la faible capacité respiratoire de ces animaux et leur grande fragilité. Le circuit gazeux utilisé fonctionne en système ouvert et achemine en continu un mélange de fluothane (1 %) et d'oxygène (3 l/min). Les lapins ont reçu au préalable la même prémédication ainsi que des mydriatiques (en excluant l'atropine 1 %, afin de limiter la durée de la mydriase postopératoire).

La chirurgie est réalisée dans des conditions similaires à celles précédemment décrites. Il est à noter que la capsule antérieure du lapin est particulièrement élastique et fragile et sera découpée par un refend central progressivement élargi pour obtenir une ouverture circulaire. La solution d'irrigation est également héparinée, afin de diminuer la réponse inflammatoire que l'on sait particulièrement importante chez le lapin. Les agents viscoélastiques sont utilisés à moindre quantité, puisque les volumes anatomiques sont faibles et surtout sont injectés avec prudence, car il faut éviter de favoriser l'atonie pupillaire en dilatant le sphincter irien brutalement au risque de majorer la pression naturelle du vitré en arrière, qui rend l'opération délicate. Si un anneau est introduit, il est glissé sous l'auvent capsulaire ; une suture de la porte d'entrée est alors rapidement mise en place afin de préserver au mieux le volume de la chambre antérieure et donc le maintien en bonne position du dispositif intracapsulaire. L'intervention s'achève également par une injection sous conjonctivale d'antibiotique et de corticoïdes et par l'application d'anti-inflammatoire pommade dans le cul-de-sac conjonctival (Sterdex ® ).

Soins et suivi postopératoires

Le traitement postopératoire comprend comme chez le microporc l'association d'agents anti-inflammatoires stéroïdiens (chibrocadron ® ) et mydriatique (tropicamide 1 %). Mais, les doses instillées sont minimisées dans leur durée (3X par jour pour trois jours, puis seulement maintien du corticoïde pour 3 autres jours à la dose de 2X par jour, puis 3 jours à 1X par jour). Le régime adopté découle de nos expériences antérieures effectuées chez le lapin, qui nous ont révélé la grande sensibilité de cet animal aux stéroïdes locaux, capables d'induire des effets généraux indésirables en cas de prescriptions prolongées à des doses excessives. Par ailleurs, la médiocre tonicité irienne, associée à une pression du vitré importante favorise la luxation du sac en avant et a fortiori la luxation du matériel éventuel qu'il contient. Il est donc important d'éviter entretenir une dilatation pupillaire défavorable.

Les 3 premiers groupes sont destinés à l'évaluation clinique comparative. Le programme du suivi prévoit une observation biomicroscopique réalisée avec une lampe à fente photographique (Topcon lab.) aux temps suivants : préopératoire, J1, J3, J7, J15, J30, J28, 4 semaines, 6 et 8 semaines. Cet examen permet une approche semi-quantitative de la réponse cellulaire et fibreuse en fonction de sa densité et de sa localisation. L'échelle adoptée fut celle proposée par Tetz [4]; elle se définit par

  • 0 : capsule claire ;
  • 1+ : cataracte secondaire périphérique, ¼ de la surface capsulaire, de faible densité ;
  • 2+ : cataracte secondaire périphérique, ½ de la surface capsulaire, de densité moyenne ;
  • 3+ : cataracte secondaire périphérique, ± centrale, de densité modérée ;
  • 4+ : cataracte secondaire diffuse, de densité sévère.

Bien entendu, un examen de l'ensemble des structures du segment antérieur est associé à celui du sac capsulaire, afin de rechercher des remaniements inflammatoires tels en particulier un oedème cornéen ou la formation d'adhérences entres les différentes structures et surtout de déterminer le positionnement de l'éventuel anneau présent.

À 2 mois, les animaux sont sacrifiés selon le même protocole que celui décrit pour les microporcs et leurs yeux droits sont recueillis et conservés dans une préparation de glutaraldéhyde en vue d'une analyse en microscopie optique et électronique à transmission (confiées au laboratoire du Dr Apple de Charleston, Caroline du Sud). Notons qu'un sacrifice plus précoce serait réalisé en cas de signe de souffrance et d'altération de l'état général d'un animal au cours de l'étude.

Le groupe 4 est réservé à l'approche de la pharmacocinétique du 5-FU in vivo. Pour ce, et dans le but de limiter le traumatisme et l'inflammation occasionnés par des ponctions répétées, deux lots sont constitués : les deux lapins du lot 1 subissent un prélèvement d'humeur aqueuse à J3 et J10, alors que les 2 lapins du lot 2 les subissent à J7 et J14. Les ponctions de chambre antérieure sont effectuées à l'aiguille (27G, recueil d'environ 100 ml), sous sédation et anesthésie topique à la tétracaïne. Finalement ces 4 animaux sont sacrifiés à 15 jours et leurs yeux droits opérés et implantés, énuclées en vue d'une analyse macroscopique destinée à l'étude du comportement de l'anneau dans le sac capsulaire.

Résultats
Complications

À l'issue de l'étude, les complications à rapporter sont les suivantes : 2 luxations des anneaux en chambre antérieure ; un cas appartenant au groupe 2 et l'autre cas au groupe 3 source d'un oedème de cornée irréductible et deux animaux prématurément décédés de l'anesthésie générale (1 lapin du groupe 1 en peropératoire et 1 lapin du groupe 2, en phase de réveil).

Deux oedèmes cornéens irréductibles ont été observés : l'un dans le groupe 1, sous la forme d'une plage supérieure occupant l'hémi-cornée et parcourue de néo-vaisseaux en regard de l'incision. Cet oedème s'est probablement installé sur suture tôt relâchée expliquant une perte d'étanchéité et un adossement de la cornée à l'iris sous-jacente. L'autre oedème a été observé dans le groupe 3. D'aspect diffus, il pouvait être la conséquence d'une implantation difficile, mais devait nous faire aussi redouter une toxicité cornéenne éventuelle de l'antimétabolique libéré.

Deux luxations d'anneaux en chambre antérieure sont apparues au décours de la première semaine postopératoire. L'une a été notée dans le groupe 2 et la seconde dans le 3. Ces bascules du dispositif en chambre antérieure sont survenues secondairement, peut-être par pression postérieure du vitré poussant sur un anneau mal ajusté au sac et non retenu par un iris atone qu'il refoule.

Aucune de ces complications oculaires n'a entraîné de retentissement général sur les animaux, qui ont pu ainsi tous être conduits à la date de sacrifice prévue.

Observations cliniques en biomicroscopie

D'une manière générale, la séquence classique des événements reconnus dans la formation de la cataracte secondaire a été retrouvée ; à savoir : existence vers J3 d'une réponse cellulaire avec apparition variable et progressive de cellules géantes se distribuant à la surface de la capsule postérieure aux alentours de J7 et J15 ; puis après résorption de la réaction fibrineuse précoce et souvent intense, installation de la fibrose sur la capsule et éventuellement sous la forme de synéchies entre les différentes structures. Plus tard, vers la 4 e semaine, sont observées des perles cellulaires d'Elshnig, suivies finalement chez le lapin d'une véritable repousse du cristallin à partir du deuxième mois.

La cotation adoptée, visant à obtenir une analyse semi-quantitative des observations biomicroscopiques, a permis de mettre en évidence une différence entre les 3 groupes concernant l'intensité et la topographie de la réaction cellulaire et fibreuse (tableaux Iet II). Cliniquement, l'amplitude de cette réaction est apparue plus importante dans le groupe 1 que dans les groupes 2 et 3, avec une localisation diffuse dans le groupe 1 alors qu'elle se concentrait à la périphérie pour les deux autres groupes porteurs d'anneaux (fig. 3à 5). Enfin, dans les cas où l'anneau est demeuré en place, il semble exercer une action efficace de tension du sac.

Observations macroscopiques

Ces données sont issues de l'examen des yeux du groupe 4, sacrifiés à 2 semaines après recueils étagés d'humeur aqueuse. L'analyse est réalisée à partir d'une coupe transversale du globe oculaire au niveau de la base du vitré, observée en vue postérieure à l'aide d'une loupe binoculaire (vue de Myake-Apple). La série considérée est certes limitée à quatre yeux, mais son étude nous a permis d'appréhender l'action du dispositif sur le sac. En dépit des ponctions successives antérieures, son positionnement est apparu effectivement en situation intrasaculaire, avec contact inconstant des deux extrémités de l'anneau, sûrement favorisé par l'expansion de ce dernier sous l'effet de l'hydratation, associé peut-être à une amorce de rétraction du sac. Ajoutons, que l'ensemble des structures oculaires, en particulier zonule et capsule sont accessibles et apparaissent préservées, en dépit du traumatisme potentiel représenté par l'insertion puis l'expansion de l'anneau.

Finalement, la mise en tension du sac et le centrage de l'anneau apparaissaient très satisfaisants, en corrélation avec les observations cliniques des groupes 2 et 3 (hormis les deux cas de luxations spontanées mentionnés (fig. 6et 7).

Approche histologique

L'analyse histologique a été effectuée par l'équipe de Charleston (S-Pandey, Pr D-Apple ; Arizona), qui a partagé son travail en deux volets. D'une part une analyse macroscopique a porté sur la détermination du retentissement de l'anneau intrasaculaire sur la repousse cristallinienne. Sa présence est inductrice d'un effet barrière sensiblement mais non significativement plus marqué en cas d'anneau relargant. Ainsi, l'anneau en position équatoriale semble arrêter la prolifération cellulaire amorcée en périphérie. Par ailleurs, la mesure du diamètre moyen du sac capsulaire n'a pas montré de différence significative entre les 3 groupes (fig. 8à 10).

Les résultats histologiques à proprement parler ont consisté en une étude de la réaction de fibrose et du comptage des cellules épithéliales résiduelles. L'analyse statistique des données (basée sur le test de « t » Student) fut semi-quantitative, considérant deux zones : périphérique et centrale et deux paramètres : l'aire et l'intensité de la PCO (tableau III). Aucune différence significative n'a pu être mise en évidence concernant la réponse périphérique, laissant apparaître une constante repousse cristallinienne à 2 mois. De même, le diamètre du sac capsulaire était globalement similaire dans tous les yeux. En revanche, dans la région centrale l'opacification capsulaire postérieure s'est avérée significativement (p = 0,035) plus importante dans le groupe 1 que dans le groupe 2 et 3. La densité des cellules épithéliales résiduelles fut notablement plus élevée dans le groupe 1, avec des valeurs moyennes de 15,66 dans le groupe 1 ; 8,94 dans le groupe 2 et 7,13 dans le groupe 3. Si la densité cellulaire est moindre dans le groupe 3, porteur d'un anneau relargant comparé au groupe 2 bénéficiant d'un anneau simple, la différence entre les deux échantillons est toutefois non significative.

Un examen en microscopie électronique à transmission a recherché les altérations éventuelles de la cornée, du sac capsulaire et de la rétine. Aucun signe de toxicité sur les structures oculaires n'a été mis en évidence, sachant cependant qu'aucune conclusion ne peut être avancée concernant l'endothélium du lapin en raison de son caractère régénératif.

Essai d'évaluation de la cinétique de libération du 5-FU sur prélèvements d'humeur aqueuse

L'approche pharmacologique réalisée à partir du groupe 4 (divisé en 2 lots, afin de minimiser le traumatisme iatrogène) représente un volet fastidieux mais hélas décevant des travaux. Il s'agissait donc de définir la cinétique de libération du 5-FU, à partir de prélèvements étagés d'humeur aqueuse (de 100 ml) successivement réalisés sur le lot 1 à J3 et J10 et sur le lot 2 à J7 et J14. Leur but était de permettre la mise en évidence ou non du principe actif dans l'humeur aqueuse et donc d'apprécier sa durée de relargage. En première étape fut pratiqué une extraction des protéines et agents contaminants (méthanol notamment) Le dosage de l'antimitotique a été effectué par méthode de HPLC (chromatographie haute performance), combinant deux colonnes en séries (colonne en C18 de 15 cm et colonne Fluofix ® de 15 cm, destinée à la séparation des composés fuorés). Une méthode de préparation particulière a dû être ajustée afin d'éviter les pics de temps de rétention identiques à celui du 5-FU sur les chromatogrammes. La détection du principe actif se fait alors par spectrométrie ultraviolets (à 255 nm), avec un temps de rétention constant de 1,52 mn. Or, un certain nombre de limites sont apparues, représentées par une difficulté parfois de séparation des pics protéiques et ceux du 5-FU. En effet, cet agent ne peut être détecté que pour des concentrations supérieures à 1 mg par ml –1 , car la persistance de pics contaminants (10-12 mn) sur le chromatogramme pourrait masquer du 5-FU éventuellement présent. Finalement, par défaut de sensibilité, la cinétique de libération du 5-FU in vivo des premiers jours postopératoires ne put être accessible. L'hypothèse de base pourtant estimait que la concentration théorique de principe actif libéré dans le volume considéré était au moins de 1 mg/ml. Mais, il est possible que l'implant ait relargué sa drogue plus rapidement in vivo ou que la libération spontanée soit plus importante durant les premières heures. La preuve ne pourrait être apportée que par un dosage de plus grande sensibilité.

Discussion

Cette étude in vivo , en dépit d'une série insuffisante, nous autorise déjà à quelques conclusions optimistes. En effet, les résultats obtenus s'accordent avec les conditions imposées par le cahier des charges

  • Notre anneau est implantable chez le lapin dans le sac capsulaire à partir d'une incision étroite et y exerce une action de mise en tension. L'estimation de la taille de la capsule cristallinienne et de celle de l'anneau étaient donc correctes. Cependant un risque de luxation est possible probablement lié aux propriétés spécifiques de l'iris et du vitré de l'oeil du lapin.
  • Son dessin devra certes être ajusté aux dimensions de l'oeil humain et aux exigences de la mise en place combinée d'une lentille intraoculaire, correspondant aux conditions de la chirurgie de la cataracte. Alors que dans cette étude, la forme de l'anneau était dictée par la nécessité de respecter un certain volume, puisque ce facteur influence la quantité de 5-FU chargée.
  • L'hydratation de l'anneau, à elle seule, pourrait assurer sa stabilisation dans le sac. La mise en tension objectivée lors de l'analyse macroscopique semble vérifier l'action mécanique du système implanté et est confirmée par le test de son élasticité in vitro

Selon l'évaluation histologique semi-quantitative, la présence de l'anneau imprégné ou non de 5-FU semble freiner l'apparition de la cataracte secondaire et la libération de 5-FU exercerait une action supplémentaire d'inhibition sur l'opacification capsulaire, au moins centrale ; sachant que le lapin présente une repousse rapide et intense de son cristallin. Si l'utilisation d'un logiciel d'analyse de la PCO à partir des images en rétroillumination numérisées était possible chez l'animal, comme elle est actuellement disponible en clinique humaine, une étude plus fine de la réponse induite par anneau relargant et non relargant pourrait peut-être dégager des différences significatives [5], [6].

En accord avec les données de la littérature, l'effet des bords carrés permettrait de renforcer l'action de barrière recherchée.

La rétraction du sac semble corrélée au degré de PCO périphérique. Un suivi plus long permettrait de confirmer cette relation. Dans ce cas, le caractère fermé ou ouvert de l'anneau pourrait jouer un rôle non négligeable.

Ce relargage prolongé du 5-FU apparaît par ailleurs sans toxicité intraoculaire démontrée.

L'étude de la cinétique de libération n'a pas permis de conclure sur le relargage du 5-FU in vivo . Si l'utilisation d'une autre méthode de préparation des échantillons d'humeur aqueuse ne permettait pas d'augmenter la sensibilité, une nouvelle étude animale pourrait être programmée pour doser le 5-FU résiduel dans le dispositif par des dosages étagés à intervalles réguliers.

CONCLUSION GÉNÉRALE

La cataracte secondaire constitue à cette heure la plus fréquente des complications de la chirurgie de la cataracte, puisqu'elle survient chez 50 % des patients 2 à 5 ans après l'intervention [7]. Elle consiste en une prolifération, une migration et une transformation myofibroblastique des cellules épithéliales persistant sur la capsule antérieure et migrant vers l'axe optique par le volet postérieur. Il en résulte l'apparition d'une fibrose responsable d'une opacification capsulaire. Le traitement de cette pathologie requière actuellement la réalisation d'une capsulotomie au laser YAG, libérant l'axe visuel. Toutefois, le coût et les dangers de cet acte encouragent le développement de moyens destinés à la prévention de la cataracte secondaire.

De multiples voies de recherche ont été explorées visant à définir les facteurs influençant la survenue de la PCO et à prévenir l'apparition de la cataracte secondaire par une suppression ou plutôt une inhibition de l'activité proliférative des cellules épithéliales résiduelles. Ainsi ont été évoqués des procédés mécaniques [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]agissant sur la technique chirurgicale et sur le dessin et la nature de l'implant, des procédés pharmacologiques [27], [28]faisant appel à des drogues capables d'influencer l'activité cellulaire ou des procédés sophistiqués récents immunologiques [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], impliquant les mécanismes d'adhésion et le rôle des facteurs de croissance.

Nous avons envisagé d'élaborer un anneau de tension capsulaire ayant la propriété de libérer un antimitotique capable d'inhiber les cellules à l'origine de la complication. Le choix du principe actif (p.a) s'est orienté vers le 5-fluorouracile, car il s'agit d'un composé bien connu de l'ophtalmologie et dont le mécanisme d'action a été établi. Le dispositif se doit de posséder une certaine tenue mécanique associée à une capacité de chargement en p.a. De plus, il doit présenter une biocompatibilité et une stabilité à long terme dans le milieu intraoculaire. Nous avons opté pour l'utilisation de polymères de la famille des hydrogels acryliques, compte tenu de leur large diffusion en ophtalmologie et de leur grande diversité offrant de multiples possibilités.

Différents copolymères ont ainsi été testés, afin de déterminer la teneur en eau à l'équilibre, les propriétés mécaniques et les caractéristiques de libération du 5-FU. Les résultats ont montré qu'en modifiant la teneur en méthyl-méthacrylate, représentant le composant hydrophobe, la teneur en eau à l'équilibre est abaissée et le relargage du p.a se trouve prolongé dans le temps. En revanche, l'augmentation de la teneur en eau à l'équilibre induit une augmentation de la quantité de 5-FU chargée dans le polymère. Un compromis dû donc être trouvé entre la quantité chargée et la cinétique de libération du p.a. Cependant, ce compromis n'a pas permis de minimiser suffisamment la libération initiale ; il fallût développer un revêtement de surface fait de poly lactide-co-glycolide, capable d'obtenir un relargage continu et prolongé. Le matériau retenu pour réaliser le dispositif final est le HPMA-MMA (75:25), dont la teneur en eau à l'équilibre est de 19 %. Le polymère non revêtu libère le 5-FU contenu en 6 à 7 jours et 70 % sont relargués en 2 heures. Lorsqu'il est recouvert de PLG, la libération de 300 mg de 5-FU s'étend sur 9 jours, avec seulement 25 % du principe actif relargués en 2 heures.

Les calculs théoriques effectués ont montré que la concentration de 5-FU dans le segment antérieur de l'oeil sera maintenue au-dessus de la concentration moyenne inhibitrice (CMI 50 de 0,50 mg/ml). Si cet antimitotique est relargué spontanément, il ne sera pas toxique pour les structures oculaires.

Le dispositif final a été imaginé pour être implanté à l'état sec et son hydratation provoque d'une part la tension du sac capsulaire et d'autre part la libération du 5-FU ; il fit l'objet d'un brevet d'invention. Les résultats préliminaires encourageants obtenus par l'étude in vitro ont permis d'engager l'évaluation animale in vivo dans le but de juger de l'efficacité de l'anneau relargant pour la prévention de la cataracte secondaire.

Les essais in vivo ont été réalisés chez le microporc du Yucatan et le lapin albinos, reconnu comme bon modèle de cataracte secondaire qu'il reproduit de façon exagérée et rapide. Notre anneau s'est avéré implantable chez les deux espèces et s'est montré doté d'une capacité de mise en tension du sac. Par ailleurs, une étude sur 2 mois de l'opacification capsulaire, mesurée en valeurs d'aire et de densité a mis en évidence une action de ralentissement du processus exercée par l'anneau, additionnée d'une aptitude à inhiber l'opacification centrale de la capsule postérieure lorsque le 5-FU est présent. Toutefois, les données concernant la cinétique de libération du 5-FU in vivo demeurent imprécises, par défaut de sensibilité de la méthode de dosage du composé par HPLC. Une autre méthode de purification des échantillons reste à étudier ; cette cinétique pourrait-elle être accessible par des dosages de 5-FU dans le dispositif après explantation ? Les études microscopiques sont en faveur de l'innocuité sur les structures endoculaires de la drogue libérée à une quantité de 300 mg sur quelques jours.

Certes, le modèle du lapin fournit des résultats qui ne permettent en rien d'apporter des conclusions transposables à l'homme. Les conclusions encourageantes de cette étude autorisent toutefois que soit envisagé le passage à l'évaluation humaine, qui exigerait un ajustage du dessin de l'anneau aux dimensions du sac capsulaire humain et surtout un approfondissement de la mesure de la cinétique du relargage du 5-FU.

Ce travail aura ainsi permis de démontrer les avantages pressentis de ce système à libération contrôlée.

L'anneau rigide non biodégradable assure des propriétés mécaniques durables sans compromettre l'intérêt optique de la chirurgie de la cataracte, puisqu'il respecte l'axe optique central et pourrait se combiner à la mise en place d'un implant. La mise en tension du sac induite préviendrait la rétraction capsulaire et pourrait de plus constituer une barrière à la migration des cellules épithéliales, grâce en partie aux bords carrés de l'anneau.

De plus, cet anneau sert de support à l'agent antiprolifératif libéré. Cette aptitude permettrait de lui conférer une action supplémentaire directe sur la multiplication cellulaire, bien que cette action n'ait pas pu être démontrée de façon absolue dans notre expérimentation. Si le 5-FU constitue l'antimétabolique le mieux exploré en ophtalmologie, son application intraoculaire et son action antimitotique peuvent être sujets à critique.

En vérité, l'étape suivante de notre approche consistera en la recherche d'un principe actif non antimitotique, mais plutôt cystostatique, mieux recevable en milieu oculaire en raison d'un risque toxique moindre et d'une action non destructrice mais stabilisatrice des cellules. Si l'on considère que l'idéal de l'implantation serait de mettre en place un biomatériau capable de mimer si bien le vivant, que les cellules à sa surface s'y comporteraient comme au contact d'une membrane basale naturelle, il est logique d'orienter l'avenir vers l'essai de molécules telles que les facteurs de croissance ou dérivés de la biologie moléculaire tels que les intégrines [41], [42], [43], [44].

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