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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 26, N° 5  - mai 2003
pp. 471-476
Doi : JFO-05-2003-26-5-0181-5512-101019-ART4
Développement de rétines foetales humaines après implantation de globes oculaires chez la souris nude
 

K. Angioi [1 et 2], R. Hatier [3], A. Duprez [2 et 4]
[1]   Service d'Ophtalmologie, CHU de Brabois, allée du Morvan, 54511 Vandoeuvre-les-Nancy Cedex.
[2]  Laboratoire de Microchirurgie Expérimentale,
[3]  Laboratoire de Microscopie Electronique,
[4]  Laboratoire d'Anatomie Pathologique, Faculté de Médecine, avenue de la forêt de Haye, 54500 Vandoeuvre les Nancy.

Tirés à part : K. Angioi [2 et 4]

[5]  , à l'adresse ci-dessus. E-mail :

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Développement de rétines foetales humaines après implantation de globes oculaires chez la souris nude

But : Analyser les interactions entre les tissus oculaires et la rétine pour déterminer les meilleures conditions de développement d'une allogreffe de rétine foetale humaine.

Matériel et méthodes : Cinquante-huit globes oculaires d'embryons de 6 à 7 semaines ou de foetus humains de 8 à 10 semaines provenant d'interruptions volontaires de grossesse ont été greffés sur le mésentère de 58 souris nude puis prélevés de 1 à 245 jours après leur implantation pour étudier le développement de la rétine en microscopie optique et électronique.

Résultats : Toutes les greffes ont pris. Vingt-six globes avaient une organisation histologique normale de la choriocapillaire, de l'épithélium pigmentaire et de la rétine neuro-sensorielle du pôle postérieur. La différentiation des photorécepteurs apparaissait vers le 80 e jour et devenait complète au 166 e jour. La rétine de la partie antérieure du globe était toujours dysplasique. Vingt-trois globes possédaient une rétine dysplasique avec des plis, des rosettes et de petites plages de nécrose. Quand l'épithélium pigmentaire était nécrosé ou dysplasique, la rétine neuro-sensorielle était toujours dysplasique ou absente. Les neuf autres globes étaient atrophiques et dépourvus de rétine.

Conclusion : Le développement d'une rétine neuro-sensorielle stratifiée avec des photorécepteurs différentiés nécessite la mise en place d'une bonne vascularisation et le développement normal d'un épithélium pigmentaire. En l'absence de ces deux conditions la rétine neuro-sensorielle est très dysplasique ou disparaît.

Abstract
Development of human fetal neuroretina grafted into nude mice

Purpose: To determine the role of different ocular tissues in the development of the human fetal neuroretina heterotopically implanted in nude mice.

Material and methods: Fifty eight eyeballs obtained from legally aborted 6- to 7-week-old embryos or 8- to 10-week-old fetuses were heterotopically implanted in nude mice. Over a period of 1–245 days, all the grafts were removed for light and electron microscopy observations.

Results: All grafts were successful. Twenty six exhibited a normal histological organization of the choriocapillaris, the retinal pigment epithelium, and the neuroretina in the posterior part of the eye. Photoreceptor differentiation was observable approximately 80 days after transplantation and was complete at 166 days. The anterior part of the retina was always dysplasic. Twenty three eyes had a dysplasic neuroretina with folds, rosettes, and necrotized areas. In absence of retinal pigment epithelium, the neuroretina was always dysplasic or absent. Nine eyes were atrophic without any differentiation of the neuroretina.

Conclusion: These results demonstrate that the development of a stratified neuroretina requires both rapid revascularization and normal development of retinal pigment epithelium. When these conditions are not met, the neuroretina becomes dysplasic or atrophic or disappears.


Mots clés : Xénogreffes de globes oculaires foetaux humains , développement rétinien , souris nude

Keywords: Human fetal retina grafting , retinal development , nude mouse


Malgré les énormes progrès de la biologie cellulaire et moléculaire offrant la possibilité théorique de traiter les affections rétiniennes dégénératives par des greffes de cellules souches ou des transferts de gènes, les essais entrepris en clinique n'ont pas encore procuré d'amélioration de la vision des patients traités [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. La découverte récente de l'existence de nombreux facteurs biologiques du développement propres à chaque espèce explique peut-être que, malgré les nombreuses études fondamentales chez l'animal, les essais cliniques ont été des échecs [9]. Le déficit des connaissances fondamentales du développement de la rétine humaine par rapport à celle des animaux de laboratoire, nécessite donc d'entreprendre des études pré-cliniques in vivo chez l'homme [10].

Les contraintes éthiques de toutes les recherches fondamentales ou thérapeutiques in vivo chez l'homme obligent désormais les chercheurs voulant mettre en évidence des facteurs spécifiques d'espèce de la différentiation et de la division cellulaire, à entreprendre une réflexion sur les méthodes à mettre en oeuvre pour assurer les progrès diagnostiques et thérapeutiques tout en préservant l'intégrité de l'homme [11].

L'ophtalmologie n'échappe pas à cette évolution de la recherche, mais espérer pouvoir réaliser des études in vivo sur des tissus oculaires humains sans impliquer l'organisme entier de l'homme semblait encore récemment totalement utopique. Les xénogreffes de globes foetaux humains chez des mammifères immuno-incompétents congénitaux, telles que les souris nude permettent pourtant de satisfaire simultanément les exigences éthiques, scientifiques et médicales.

MATÉRIEL ET MÉTHODE
Les globes oculaires foetaux humains

Cinquante-huit yeux embryonnaires ou foetaux humains, de 0,8 à 2 mm de diamètre, provenant d'embryons ou de foetus de 6 à 10 semaines ont été recueillis immédiatement après l'interruption volontaire de grossesse (IVG). Le recueil et la greffe ont été réalisés en appliquant strictement la recommandation de 1982 du Comité National d'Ethique [12]. Les tissus péri-oculaires ont été soigneusement disséqués et les yeux conservés à + 4°C dans du sérum glucosé isotonique pendant 1 à 2 heures lorsqu'ils ne pouvaient pas être immédiatement greffés.

Les souris nude

Toutes les expérimentations ont été réalisées en conformité avec les décrets du Service Vétérinaire de la Santé et de la Protection Animale du Ministère de l'Agriculture, relatifs à l'expérimentation animale. Les cinquante-huit souris nude pangéniques mâles de 6 à 8 semaines, de souche Swiss, pesant 21 ± 0,5 g, nécessaires pour cette étude provenaient du centre d'élevage Iffa Credo de Lyon. Durant toute l'étude, ces souris ont été élevées dans des cages individuelles et nourries avec les aliments habituels des rongeurs (bouchons pour rongeurs).

La technique chirurgicale

La technique de xénogreffe utilisée pour cette recherche a été publiée antérieurement [13], nous la résumerons donc brièvement. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale obtenue par des injections intra-péritonéales de 0,1 mg de kétamine par gramme de poids corporel (Parke-Davis, Courbevoie, France). Toutes ces greffes sont réalisées de façon stérile avec des instruments d'ophtalmologie et sous un microscope opératoire.

Les implantations intra-abdominales des globes oculaires, sont, après une laparotomie xipho-pubienne, réalisées sur le mésentère et l'intestin grêle après extraction d'une anse digestive de la cavité abdominale. L'oeil humain foetal est fixé par 6 à 8 points de fil Nylon 9/0 ou 10/0 passant dans le mésenchyme oculaire et dans le tissu conjonctif péri-vasculaire des branches des vaisseaux du mésentère et du bord péritonéal de l'intestin grêle (fig. 1a). La laparotomie est refermée en deux plans.

Les techniques histologiques

Les techniques histologiques utilisées pour cette étude ont elles aussi été publiées antérieurement [14]nous les rapportons donc elles aussi brièvement. Pour les études en microscopie optique, les greffons, immédiatement après leur ablation, sont fixés dans du formol tamponné, inclus en paraffine, coupés à 5 microns et colorés à l'hématoxyline, éosine, safran ou avec un anticorps anti-vimentine humaine spécifique, selon la méthode peroxydase anti-peroxydase (PAP), pour différentier les cellules humaines et murines. Pour les études en microscopie électronique, les globes prélevés sont fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 %, inclus en épon et débités en coupes semi-fines ou ultra-fines. Les coupes semi-fines sont colorées à l'Azur bleu II et les ultra-fines à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb.

RÉSULTATS
Résultats à court terme (première semaine)

Durant les deux premiers jours, le greffon a un aspect macroscopique semblable à celui qu'il avait au moment de l'implantation. Dès le troisième jour de greffe, un fin réseau capillaire s'échappant des vaisseaux mésentériques apparaît (fig. 1b)puis se développe régulièrement (fig. 1c). L'étude histologique au troisième jour découvre dans les vaisseaux du mésenchyme oculaire, uniquement formés de cellules endothéliales humaines (comme le prouve l'étude immunohistochimique), de petites hématies ayant les caractéristiques des globules rouges de souris. L'étude histologique à cette période met en évidence trois aspects très différents

  • un épithélium pigmentaire et une rétine neuro-sensorielle sub-normaux (fig. 1d);
  • un épithélium pigmentaire et une rétine neuro-sensorielle oedémateuse et séparés l'un de l'autre par 2 à 3 couches de petites cellules indifférenciées (fig. 1e);
  • un épithélium pigmentaire et une rétine neuro-sensorielle en grande partie nécrosés avec paradoxalement quelques îlots de petites cellules nerveuses préservées.

Résultats à moyen terme (à partir de la deuxième semaine)

Par la suite, le réseau capillaire continue à se développer (fig. 1c)puis se simplifie pour constituer seulement deux à trois «gros vaisseaux » raccordant l'oeil à l'hôte. Trois aspects histologiques différents peuvent être décrits

  • des rétines stratifiées en contact étroit avec l'épithélium pigmentaire uni-stratifié doublé d'une choriocapillaire normale. Mais la rétine normale est toujours localisée uniquement au pôle postérieur du globe alors que toute la zone rétro-lentale est occupée par une prolifération rétinienne constituée de rosettes, de plis ou de massifs ;
  • des rétines totalement dysplasiques comme celles découvertes dans la zone rétro-lentale mais occupant tout le segment postérieur et prenant alors l'aspect d'un pseudo-rétinoblastome ;
  • enfin, dans les yeux atrophiques, la rétine neuro-sensorielle a disparu et l'épithélium pigmentaire est remplacé par des îlots de mélanophages.

Résultats à long terme (à partir de 3 mois)

Après trois à quatre mois de greffe, lorsque la rétine est stratifiée avec un épithélium pigmentaire normal et bien accolé à la rétine neuro-sensorielle, les photorécepteurs, les neurones des diverses couches et les cellules de Müller se différentient et les limitantes se mettent en place (fig. 1f, 1get 1j)ainsi qu'une membrane de Bruch et des capillaires fenêtrés. Au contact de la rétine, il existe un tissu lâche non vascularisé rappelant le vitré. Des synapses entre les photorécepteurs et des neurones ayant en microscopie électronique l'aspect de cellules bipolaires apparaissent (fig. 1j). À l'inverse les cellules ganglionnaires, subissent toujours une vacuolisation (fig. 1f)après une différentiation initiale avec une fibrillogénèse sub-normale et une migration axonale vers la papille présomptive. Cependant, le nerf optique ne se reconstitue jamais.

Lorsque l'épithélium pigmentaire est dysplasique ou absent, les cellules foetales de la rétine neuro-sensorielle sont capables de se diviser et de se différentier partiellement, mais la structure générale est alors toujours totalement désorganisée avec la présence de nombreux plis et rosettes occupant tout le globe (fig. 1h), donnant à l'oeil un aspect de pseudo-rétinoblastome.

Au total, pour les 3 périodes (court, moyen et long terme) nous avons obtenu 26 rétines sub-normales bien stratifiées (provenant de globes de 7 à 10 semaines de grossesse), 23 rétines dysplasiques (provenant elles aussi de globes de 7 à 10 semaines de grossesse) et 9 globes atrophiques dépourvus de rétine (provenant de globes de 6 à 9 semaines de grossesse). Dans cette petite série, il n'est pas apparu de relation entre la différenciation du tissu rétinien constatée en microscopie optique et électronique et l'âge de l'embryon ou du foetus au moment de la greffe du globe.

DISCUSSION

Parmi les quelques animaux congénitalement immuno-déficients actuellement connus, seules les souris immuno-incompétentes (souris nude et souris SCID…) ne rejettent pas les xénogreffes d'organes humains tout en permettant à leurs tissus de conserver leurs caractéristiques histologiques et histogénétiques originelles.

La souris nude, découverte par hasard il y a plus de trois décennies, se caractérise par une absence congénitale de thymus et de poil. Cette athymie paradoxalement non létale résulte d'une mutation monogénique autosomique récessive parfaitement supportée. L'absence de lymphocytes T a transformé cette souris en un animal d'expérience d'une grande importance. En effet, toutes les xénogreffes sont parfaitement tolérées sans que l'hôte ne doive être soumis à une immunosuppression qui modifierait tellement la division et la différentiation des cellules du greffon que l'expérience perdrait tout intérêt. Depuis sa découverte, cette souris a essentiellement été utilisée en oncologie expérimentale mais toujours avec des modalités de greffe tissulaire rudimentaires puisque les implantations sont réalisées avec un trocart et le plus souvent simplement sous la peau. Pour disposer d'un modèle universel de xénogreffe d'organes foetaux, la création d'une microchirurgie de transplantation adaptée à la taille de cet animal était donc indispensable [15]. Jusqu'à ces dernières années, une telle recherche de chirurgie expérimentale n'a, à notre connaissance, jamais été entreprise de façon systématique notamment en ophtalmologie [16].

Compte tenu de la taille des vaisseaux (100 microns de diamètre environ), il est impossible de réaliser, par microanastomoses vasculaires, des greffes vascularisées d'organes foetaux. Il est donc indispensable d'implanter les greffons dans des zones hyper vascularisées pouvant assurer une nutrition initiale par diffusion interstitielle puis une rapide néoangiogénèse capillaire. Les vaisseaux du mésentère et du bord des anses digestives satisfont parfaitement cette double exigence. De plus, la cavité abdominale par son grand volume par rapport à son contenant ne soumet le greffon à aucune contrainte mécanique susceptible de modifier son développement [13], [16].

Toutes les greffes allogéniques ou xénogéniques de tissus ou d'organes sont soumises selon les cas à une colonisation minime ou importante par des cellules de l'hôte [14]. Ainsi pour s'assurer que le fonctionnement cellulaire et global du greffon est semblable à celui de son homologue chez son hôte d'origine et pouvoir étudier les migrations cellulaires participant à l'histogenèse, il est indispensable de caractériser avec certitude l'origine humaine ou murine des cellules de la greffe. Les techniques d'hybridation in situ avec des sondes d'ADN humain et murin ou de marquages immunohistochimiques avec des anticorps spécifiques d'espèce, permettent de découvrir avec une certitude absolue l'origine humaine ou murine de toutes les cellules nucléées des greffons [14].

Malgré une ischémie à 37 degrés dans l'organisme de la souris après transplantation, de plus de 48 heures, les rétines des greffons, implantés avec cette méthode, survivent et parviennent ensuite, selon l'efficacité locale de la revascularisation, à un développement sub-normal dans 45 % des cas (fig. 1fet 1g)ou dysplasique (fig. 1h)dans 40 % des cas environ. Les raccordements des capillaires oculaires humains, néo-formés par vasculogenèse (fig. 1e)aux vaisseaux de l'hôte produit par néo-angiogenèse (fig. 1b), rétablissent la circulation dans le greffon dès le troisième jour de greffe.

L'étude histologique et ultra structurale montre que l'organisation de la rétine neurosensorielle en strates normales n'est possible qu'en présence d'un épithélium pigmenté uni-stratifié normal, en contact direct avec elle sans décollement ni interposition de mésenchyme [17]. L'épithélium pigmentaire foetal et une mince couche de mésenchyme [18]de la sclère présomptive sont indispensables à la revascularisation et à l'organisation coordonnée de la choriocapillaire [19]et des couches externes de la rétine neurosensorielle [20](fig. 1f). Dans les conditions expérimentales utilisées, l'organisation morphologique de la rétine ne semble pas être liée à l'âge gestationnel du greffon mais dépend beaucoup de la rapidité de la revascularisation.

Le développement de la rétine foetale humaine, comme celle de beaucoup d'animaux [21]dépend donc non seulement de nombreux facteurs de croissance produit in situ , mais aussi de contacts physiques d'abord entre les cellules de l'épithélium pigmentaire [22]et les cellules de la rétine neuro-sensorielle externe en cours de différentiation. [23](fig. 1get 1i)puis entre celles-ci lors de la synapsogenèse [24](fig. 1j). Ces contacts, qui s'établissent selon une chronologie et une organisation spatiale précises entre des structures histologiques successives, permettent un déroulement génétiquement programmé du développement mais modulé par des stimuli épigénétiques provenant de l'environnement histologique local. Tout se passe donc comme si les cellules de la rétine neuro-sensorielle, sauf les cellules ganglionnaires assurant la connexion terminale avec le système nerveux central, pouvaient se différentier en autarcie [25]si toutes ces cellules restent dans l'organisation spatiale acquise avant le prélèvement.

Ces constatations incitent donc à penser que des greffes foetales composites (épithélium pigmentaire, rétine neurosensorielle et une fine couche de mésenchyme de sclère présomptive) pourraient éviter les désorganisations spatiales du greffon et favoriser ainsi la poursuite de la différenciation de ces cellules. Mais beaucoup d'études de biologie moléculaire seront encore nécessaires pour comprendre les mécanismes de ces évolutions morphologiques.

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