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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 26, N° 7  - septembre 2003
pp. 675-679
Doi : JFO-09-2003-26-7-0181-5512-101019-ART3
Retentissement conjonctival des conservateurs : étude comparative de collyres bêta-bloquants conservés et non conservés chez des patients glaucomateux
 

P.J. Pisella [1], E. Lala [1], V. Parier [1], F. Brignole [2], C. Baudouin [3]
[1]  Service d'Ophtalmologie, CHU de Tours, Hôpital Bretonneau, 2, boulevard Tonnellé, 37044 Tours Cedex 1.
[2]  Laboratoire de Toxicologie, Faculté des Sciences pharmaceutiques et biologiques, Université Paris 5, René Descartes.
[3]  CHNO des Quinze-Vingts, Paris, Hôpital Ambroise Paré, APHP, UFR Paris Ouest.

Tirés à part : P.J. Pisella [3]

[4]  , à l'adresse ci-dessus. E-mail :

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Retentissement conjonctival des conservateurs : étude comparative de collyres bêta-bloquants conservés et non conservés chez des patients glaucomateux

But : Comparer l'effet d'un bêta-bloquant conservé ou non conservé sur l'épithélium conjonctival de patients glaucomateux.

Méthodes : Étude rétrospective par empreinte conjonctivale (EC) conduite sur des patients traités par timolol avec ou sans chlorure de benzalkonium (BAC). Les patients ont été répartis en deux groupes comparables en âge et en durée de traitement au minimum égale à un an. Quinze yeux de 15 patients traités par timolol 0,5 % contenant 0,01 % de BAC (timolol, BAC+) et 17 yeux de 17 patients traités par timolol 0,5 % sans conservateurs (timolol, BAC–) ont été inclus. Les prélèvements par EC ont été analysés par cytométrie en flux en utilisant les anticorps anti- HLA DR et ICAM-1 pour le profil inflammatoire et anti-M1/MUC5AC pour la détection des mucines conjonctivales.

Résultats : Les deux marqueurs d'inflammation voyaient leur niveau d'expression augmenter significativement dans le groupe timolol, BAC+ comparé au groupe timolol, BAC–. Parallèlement, le nombre de cellules à mucus était significativement diminué dans le groupe bêta-bloquant conservé par rapport au groupe sans conservateurs.

Conclusion : Cette étude réalisée chez des patients traités confirme le caractère toxique du chlorure de benzalkonium sur la conjonctive avec apparition d'un profil inflammatoire et d'une modification de structure de l'épithélium de surface.

Abstract
Effect of preservatives on the conjunctiva: a comparative study of beta-blocker eye drops with and without preservatives in glaucoma patients

Purpose: To compare the effect of timolol with or without preservatives on the conjunctival epithelium of glaucoma patients.

Methods: A retrospective study using impression cytology (IC) was conducted on patients treated with 0.5% timolol with or without 0.01% benzalkonium chloride (BAC). Fifteen eyes from 15 patients treated with timolol, BAC+ and 17 eyes from 17 patients treated with timolol, BAC– were included in two groups comparable for age and duration of treatment lasting at least 1 year. Specimens were analyzed by flow cytometry for inflammatory profile (using antibodies directed against HLA DR and ICAM-1) and mucin detection (anti-M1/MUC5AC antibody).

Results: IC analyses showed a significant increase in the expression of the two inflammatory markers, HLA DR and ICAM-1 in the timolol, BAC+ group and also a significant decrease in goblet cell density in the same group as compared to the timolol, BAC– group.

Conclusion: The use of long-term preserved beta-blocker in glaucoma patients is associated with a direct subclinical epithelial toxicity in the conjunctiva, as already demonstrated by previous experimental studies.


Mots clés : Conjonctive , chlorure de benzalkonium , glaucome , inflammation

Keywords: Conjunctiva , benzalkonium chloride , glaucoma , inflammation


INTRODUCTION

De nombreuses manifestations oculaires de surface ont été décrites lors de l'utilisation de médicaments au long cours. Les collyres antiglaucomateux prescrits dans le traitement du glaucome primitif à angle ouvert sont les mieux étudiés. Cette pathologie nécessite des traitements parfois multiples, le plus souvent prolongés pendant de nombreuses années, qui peuvent induire sur des conjonctives initialement vierges et normales des manifestations inflammatoires sévères. Au long cours, ces collyres peuvent entraîner de nombreux types de complications au niveau de la surface oculaire, à type de réactions allergiques [1], [2], d'installation rapide ou retardée, ou d'irritation locale. Il s'agit le plus souvent d'atteintes bénignes (prurit, conjonctivite chronique papillaire, kératites ponctuées superficielles, raccourcissement du BUT), parfois sévères (pseudopemphigoïdes oculaires et conjonctivites cicatrisantes auto-immunes) [3], [4]. Les collyres conservés peuvent compromettre le traitement d'un syndrome sec associé ou aggravé par l'action détergente des conservateurs sur le film lacrymal et sur les microvillosités épithéliales [5], [6]. De plus ces collyres conservés peuvent causer une atteinte fibrotique de la conjonctive entraînant un échec de la chirurgie filtrante par blocage du site de filtration [7], [8].

La présence de signes histologiques d'inflammation conjonctivale est plus fréquente chez les patients glaucomateux traités au long cours : infiltrats inflammatoires dans le stroma sous-epithelial, expression par l'épithélium conjonctival de protéines liées à l'inflammation HLA-DR et ICAM-1, et à un stade plus avancé, une évolution vers la métaplasie épithéliale conjonctivale [9], [10].

L'action toxique des conservateurs sur la surface oculaire a été largement démontrée aussi bien in vitro qu' in vivo chez l'homme et l'animal [9], [11], [12], [13]. Cependant, peu d'études ont été faites sur la comparaison quantitative et qualitative de la toxicité des bêta-bloquants avec et sans conservateur.

Le but de ce travail est d'établir et de comparer la toxicité conjonctivale des bêta-bloquants avec et sans conservateur chez l'homme après prélèvements par empreintes conjonctivales.

MATÉRIEL ET MÉTHODES
Patients

Trente-deux yeux de 32 patients traités par collyres antiglaucomateux depuis au moins 1 an ont été inclus dans cette étude (tableau I). Deux groupes de patients ont été individualisés : le premier groupe incluait 15 yeux (15 patients) traités par timolol conservé par chlorure de benzalkonium (Timoptol ® , Laboratoires MSD Chibret, Clermont-Ferrand, France) à 0,01 % (groupe timolol, BAC +), le second comptait 17 yeux (17 patients) traités par timolol sans conservateur (Timabak ® , Laboratoires THEA, Clermont-Ferrand, France) (groupe timolol, BAC–). Ces deux groupes de patients étaient appariés en âge et en durée de traitement.

Prélèvements

Les empreintes conjonctivales ont été obtenues selon des procédures validées en appliquant sur la conjonctive bulbaire supérieure un filtre opaque d'acétate de cellulose (type Gelman Supor ® ; Gelman Sciences, MI, USA) après anesthésie de contact (oxybuprocaïne à 0,04 %). Le prélèvement était réalisé au moins 15 minutes après la fin de l'examen biomicroscopique.

Toutes les membranes étaient ensuite immédiatement placées dans un tube contenant 1,5 ml de tampon phosphate (PBS pH : 7,4) avec un fixateur (0,05 % de paraformaldehyde, préparé mensuellement). Les tubes étaient conservés à 4 °C et analysés dans la semaine suivant le recueil conjonctival.

Analyse par cytométrie en flux

L'extraction cellulaire a été réalisée manuellement par agitation des membranes pendant 15 minutes suivie d'une centrifugation à 1 600 tours/min pendant 5 minutes.

Trois anticorps et leurs contrôles négatifs ont été utilisés pour cette étude : un anticorps dirigé contre l'antigène de classe II HLA-DR, un anticorps anti-ICAM-I (ou CD54). L'anticorps utilisé pour la détection des cellules à mucus était représenté par l'anti-Ml/MUC5AC précédemment décrit. Les anticorps primaires étaient pour l'anti HLA-DR, une IgGl de souris (50 pg/ml, Dako SA, Copenhagen, Denmark), ainsi que pour l'anti-CD54 (clone 6.5B5, Dako). L'anticorps anti-mucine était également une IgG de souris. Une IgG1 non immune de souris a été utilisée comme témoin isotypique et une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à la FITC comme anticorps secondaire. La dilution des anticorps primaires était de 1:50 pour l'anti-HLA-DR et l'anti CD54 et de 1:500 pour l'anti-Ml/MUC5AC, d'après des études précédentes dans du PBS contenant 1 % de sérum albumine bovine [14]. Après 30 minutes d'incubation, les suspensions cellulaires ont été lavées dans du PBS avec centrifugation de 5 minutes puis incubées avec l'anticorps secondaire anti-souris à la dilution de 1:50 pendant 30 minutes. À la fin de l'incubation, les cellules ont été centrifugées dans le PBS (1 600 tours/min, 5 minutes), suspendues dans 500 ml de PBS, et analysées par cytométrie en flux (Coulter Epics-XL) selon des méthodes antérieurement validées.

L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée avec un cytomètre Epics-XL Beckman Coulter (Beckman coulter, Miami, Floride). Pour chaque anticorps mesuré, un minimum de 1 000 cellules conjonctivales a été acquis sous forme d'histogramme biparamétrique dont l'ordonnée représente la taille cellulaire et dont l'abscisse représente la densité cellulaire, tous les deux exprimés en mode linéaire. Les prélèvements contenant moins de 10 000 cellules ont été exclus. L'expression des fluorescences au niveau des populations cellulaires est présentée sous forme d'histogrammes logarithmiques. Pour chaque anticorps testé, les résultats sont donnés en pourcentage de cellules positives et en intensité moyenne de fluorescence.

Les niveaux d'intensité de fluorescence sont par la suite quantifiés par la méthode QIFI (Quantitative Indirect Fluorescence Intensity, Dako). Des billes de calibration marquées par cinq niveaux d'anticorps monoclonaux ont été inclus dans chaque procédure technique et ont réagi avec une immunoglobuline secondaire de chèvre anti-souris conjuguée à la FITC dans le même temps et de la même façon que les empreintes conjonctivales. L'obtention d'une courbe de calibration par la méthode des billes permet de relier l'intensité moyenne de fluorescence de chaque bille au nombre d'anticorps fixés, ceci définissant une unité de capacité de fixation de l'anticorps appelée ABC (Antibody Binding Capacity). Cette courbe permet une quantification de la fluorescence exprimée par les cellules conjonctivales après avoir converti les intensités moyennes de fluorescence observées pour chaque anticorps en unités ABC. Le nombre réel d'ABC pour un marqueur est obtenu en soustrayant le nombre d'ABC trouvé au contrôle négatif. Cette méthode permet une comparaison objective des différents échantillons et augmente la fiabilité et la qualité des mesures en fluorescence. Toutes les procédures de cytométrie ont donc été réalisées selon des méthodes antérieurement validées.

Analyse statistique

Les comparaisons statistiques ont été réalisées avec le test de Mann-Whitney avec niveau de significativité de 0,05 % (Statview IV ® for Windows, Abacus, Berkeley, CA).

RÉSULTATS
Analyse par cytométrie en flux

Les résultats exprimés en pourcentage de cellules positives et en intensité de fluorescence pour chaque marqueur sont regroupés dans le tableau IIet la figure 1.

Le pourcentage moyen de cellules épithéliales positives au HLA DR était significativement plus élevé dans le groupe timolol, BAC + (35,7 % ± 24,6 %) comparé au groupe sans conservateur (7,4 % ± 6,4 %, p < 0,0001). Le niveau moyen d'intensité de fluorescence était également significativement plus élevé dans le groupe timolol, BAC+ (62,541 ± 75,720 ABC) que dans le groupe timolol, BAC– (6,768 ± 12,542 ABC, p = 0,009).

L'analyse du marqueur ICAM-1 (CD54) était exactement superposable à celle du HLA-DR avec un pourcentage de cellules positives significativement plus élevé dans le groupe avec conservateurs (23,9 % ± 18,8 %) comparé au groupe timolol, BAC– (5,8 % ± 4,2 %, p = 0,0006) ainsi que le niveau moyen de fluorescence (33,524 ± 37,676 ABC pour le groupe timolol, BAC + contre 5,559 ± 8,236 ABC pour le groupe timolol, BAC -, p = 0,005).

L'analyse du nombre de cellules à mucus retrouvait une moyenne de 2,8 % ± 1,4 % dans le groupe timolol, BAC+ contre 11,9 % ± 12 % dans le groupe timolol, BAC– ( p = 0,007). L'analyse de la fluorescence était également superposable (760,620 ± 41,049 ABC pour le groupe avec conservateur contre 289,908 ± 183,759 ABC pour le groupe sans conservateur, p = 0,0003).

DISCUSSION

Pour la première fois, une étude ex vivo chez l'homme met en évidence un niveau d'inflammation significativement inférieur au niveau de l'épithélium conjonctival de patients recevant un collyre bêta-bloquant non conservé comparé à ceux recevant un collyre bêta-bloquant conservé. De précédentes études avaient pu mettre en évidence une toxicité supposée du conservateur sur la conjonctive expérimentalement chez l'animal [13]ou après enquête épidémiologique chez l'homme [15], [16]. Le recueil des signes fonctionnels et cliniques sur une cohorte de patients glaucomateux au cours de deux consultations à six mois d'intervalle avaient montré une diminution significative des signes fonctionnels et cliniques dans le groupe de patients ayant bénéficié d'un changement de traitement d'une version conservée à une version non conservée de timolol [15]. Ces résultats étayaient et affinaient ceux retrouvés par Broadway et al. [17], [18]montrant une réaction inflammatoire présente sur la conjonctive de patients glaucomateux traités par collyres à l'époque tous conservés. Ainsi, la notion de facteurs de risque de fibrose conjonctivale et d'échec de chirurgie filtrante avait pu être mise en évidence. La toxicité des conservateurs, en particulier des ammoniums quaternaires, sur le film lacrymal était également établie depuis longtemps. Cependant, ce n'est que très récemment qu'une toxicité directe du chlorure de benzalkonium (BAC), chef de file des ammoniums quaternaires, sur la cellule épithéliale conjonctivale a pu être démontrée [19]. Les mécanismes impliqués dans cette toxicité sont directement liés à des phénomènes d'apoptose ou de nécrose en fonction des concentrations de BAC [20]. Cependant, ces travaux ont été pour l'essentiel conduit expérimentalement, en laboratoire, sur des cultures de cellules conjonctivales humaines. Les résultats de cette étude sont les premiers à confirmer, à partir de prélèvements ex vivo , la présence d'une inflammation conjonctivale infraclinique sur des yeux traités en monothérapie bêtabloquant avec conservateurs.

L'analyse des résultats retrouve également une différence significative du nombre des cellules à mucus, significativement abaissé dans le groupe de patients traités par collyres conservés. Cette destruction des cellules caliciformes traduit une souffrance chronique de l'épithélium conjonctival déjà mise en évidence par empreinte conjonctivale chez des patients souffrant de pathologies chroniques à composante inflammatoire comme la kérato-conjonctivite sèche ou la rosacée oculaire [21].

Le chlorure de benzalkonium à la concentration de 0,01 % présent dans les collyres apparaît comme responsable d'une double action toxique, indirecte par effet détergent sur la phase lipidique du film lacrymal et directe sur les cellules épithéliales conjonctivales. Cette toxicité a également été confirmée in vitro sur cellules conjonctivales humaines en culture [22].

L'utilisation de collyres dans les pathologies chroniques comme le glaucome chronique ou la sécheresse oculaire implique, lors d'une association à un conservateur, l'apparition d'une réaction inflammatoire locale, le plus souvent infraclinique non liée à un mécanisme allergique beaucoup plus rare. Cette inflammation induit ou renforce l'apparition de signes fonctionnels et cliniques chez les patients et hypothèque les chances de succès d'une possible chirurgie filtrante ultérieure. Le meilleur traitement reste donc la prévention par l'utilisation dans la mesure du possible de collyres non conservés et en nombre restreint.

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