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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 26, N° 7  - septembre 2003
pp. 725-729
Doi : JFO-09-2003-26-7-0181-5512-101019-ART10
Intérêt de la cytométrie en flux et de l'index de prolifération cellulaire dans le mélanome choroïdien
 

M.-L. Ranty [1], J.-C. Quintyn [2], P. Courville [1], G. Brasseur [2]
[1]  Service d'Anatomie et de Cytologie Pathologiques,
[2]  Service d'Ophtalmologie, CHU Charles-Nicolle, boulevard Gambetta, 76031 Rouen.

Communication orale présentée lors du 108 e congrès de la SFO, en mai 2002.


Tirés à part : M.-L. Ranty [2]

[3]  , à l'adresse ci-dessus. E-mail :

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Intérêt de la cytométrie en flux et de l'index de prolifération cellulaire dans le mélanome choroïdien

But : Évaluer la valeur pronostique de l'ADN-ploïdie et de l'index de prolifération cellulaire dans l'apparition de métastases après énucléation pour mélanome choroïdien.

Patients et méthode : Nous avons effectué une étude rétrospective sur 14 patients (8 hommes, 6 femmes) en utilisant la cytométrie de flux et un immuno-marquage avec l'anticorps anti-Ki67.

Résultats : En cytométrie de flux, 2 tumeurs étaient ADN-aneuploïdes, les 12 autres étaient ADN-diploïdes. L'index de prolifération cellulaire était compris entre 0 % et 16 %. Trois patients ont développé des métastases. Les tumeurs étaient ADN-diploïdes et avaient un index de prolifération peu élevé. Le type cellulaire était mixte. Le suivi moyen était de 3 ans et 9 mois.

Discussion et conclusion : Il n'a pas été mis en évidence une corrélation entre la ploïdie et l'index de prolifération cellulaire et l'apparition de métastases. Le meilleur critère pronostique demeure l'effraction sclérale.

Abstract
The advantages of DMA ploidy pattern and all proliferation index in choroidal melanoma

Purpose: To evaluate the prognostic value of DNA ploidy and proliferative activity in metastasis occurrence after enucleation for choroidal melanomas.

Methods: This retrospective study investigated 14 patients (eight males, six females) using flow cytometry and immunohistochemistry with the Ki67 antibody.

Results: Two of the tumors were aneuploid, 12 were diploid. The proliferation index was between 0% and 16%. Two tumors progressed to metastatic disease; both were diploid and had a low proliferation index. They were mixed cell type. The median observation period was 3 years and 9 months.

Conclusion: DNA content and proliferative activity are not correlated with metastasis occurrence. Sclera invasion is the best prognostic factor.


Mots clés : Mélanome choroïdien , cytométrie en flux , Ki67

Keywords: Choroidal melanoma , DNA content , proliferative activity


INTRODUCTION

De nombreux critères de prédictibilité de l'apparition de métastases après une énucléation de mélanome choroïdien ont été utilisés comme la localisation de la tumeur, la monosomie 3P [1], la taille tumorale, les anomalies intravasculaires tumorales [2], l'index mitotique, la pigmentation et le type cellulaire [3]. La classification de Callender, revue par Mc Lean, Foster et Zimmerman [4], est ainsi usitée pour tenter de prévoir l'évolution des mélanomes uvéaux ; les cellules mélaniques de type épithélial seraient associées à un pronostic plus péjoratif que celles de type fusiforme [3], [4].

L'interprétation de ces critères histologiques est parfois difficile. Nous avons donc tenté, dans cette étude, d'évaluer la valeur pronostique de deux méthodes facilement reproductibles dans l'apparition de métastases d'origine choroïdienne : la cytométrie en flux, et l'index de prolifération cellulaire évaluée par l'anticorps anti-Ki67. La cytométrie en flux (CMF) permet une mesure du contenu en ADN du noyau des cellules [5]. Lorsque les cellules normales contiennent 2n chromosomes, elles sont dites diploïdes. Un contenu en ADN différent de 2n chromosomes est anormal et définit l'aneuploïdie.

PATIENTS ET MÉTHODE
Patients

Il s'agissait d'une étude rétrospective portant sur 23 patients énucléés dans le service d'Ophtalmologie du CHU de Rouen pour mélanome choroïdien entre 1990 et 2001. Afin d'homogénéiser la population, les tumeurs iriennes n'ont pas été incluses dans cette étude. En effet, contrairement aux mélanomes de l'uvée postérieure, la plupart des mélanomes iriens n'occasionnent que rarement des métastases à distance [6].

Les pièces d'énucléation ont été fixées dans le formol à 4 %, puis incluses en paraffine.

Méthode

À l'aide d'un microtome, il a été réalisé des coupes de 4 mm d'épaisseur d'une part, pour effectuer des colorations par l'hématéine-éosine-safran, le PAS (periodic acid Schiff) et l'étude immuno-histochimique et d'autre part, des coupes de 50 mm d'épaisseur destinées à la technique de cytométrie en flux.

Immunohistochimie

L'étude a été réalisée sur des préparations histologiques déparaffinées puis réhydratées. Après un passage au micro-onde dans un tampon citrate (pH6), les étapes suivantes ont été réalisées par un automate. Les coupes ont été traitées par une solution d'hydrogène péroxyde (H 2 0 2 ), puis mises au contact de sérum normal. Cette opération a été suivie d'une incubation de la coupe avec l'anticorps de souris monoclonal anti-Ki67 (Immunotech) (à partir du clone MIB1) à la dilution de 1/100 e . Après lavage, les coupes ont été incubées avec un second anticorps biotinylé, qui s'est lié au premier anticorps par l'un de ses sites ; l'autre site libre biotinylé se liant au complexe streptavidine-peroxydase (kit Lsab, Dako). Le complexe ainsi formé a été mis en évidence par addition du substrat chromogène : le 3-amino-9-éthylcarbazole dans du N, N-diméthyl-formamide (AEC), solution chromogène Dako, AEC/H 2 O 2 substrate (fig. 1).Les lames ainsi obtenues ont subi une contre-coloration par l'hémalun puis ont été recouvertes d'une lamelle avec un montage à l'eau (Aquatex, Merk). La présence de l'antigène recherché se traduit par une coloration rouge, alors que le reste de la lame est coloré en bleu par l'hémalun. Le pourcentage de noyaux marqués a été établi sur 2 500 cellules dans les zones comportant le plus grand nombre de cellules marquées.

Cytométrie en flux

La technique utilisée pour l'étude en cytométrie en flux (CMF) sur ce type d'échantillon, à partir de bloc inclus en paraffine, était inspirée de la méthode de Hedley [7]. Les coupes étaient déparaffinées par des passages successifs dans des bains de xylène, déshydratées progressivement dans des bains d'alcool de concentrations décroissantes puis rincées dans de l'eau distillée. Les coupes étaient alors soumises à l'action d'une enzyme (1 ml de pepsine à 0,5 % dans une solution de sodium à 9 ), puis rincées dans une solution de tampon PBS. Il a été ajouté ensuite 0,5 ml de RNAse. La coloration des noyaux a été réalisée par de l'iodure de propidium, qui s'intercalait sur la molécule d'ADN.

La lecture a été effectuée ensuite sur un cytomètre (Epics XL, Coulter Beckman) équipé d'un laser argon qui émettait à 488 nm ; la fluorescence réémise spécifique du colorant était recueillie à 625 nm. La détection et la mesure de la fluorescence émise par l'iodure de propidium, sur la suspension cellulaire obtenue à partir des coupes en paraffine, permettaient une quantification de la teneur en ADN de l'ensemble des cellules d'un fragment tissulaire et d'établir un histogramme (fig. 2aet 2b)ou une courbe du cycle cellulaire.

Cet histogramme permet de déterminer l'index d'ADN tumoral (DI). Cet index d'ADN est établi par comparaison du contenu en ADN du tissu tumoral avec un tissu histologiquement non-tumoral, ce dernier devenant le tissu de référence « normal » en contenu d'ADN :

Ce tissu de référence est qualifié « d'ADN-diploïde » ; son index est de 1. Si le contenu en ADN (en G0G1) du tissu à étudier se superpose au contenu en ADN (en G0G1) du tissu de référence son index d'ADN sera de 1/1 = 1. Il sera donc ADN-diploïde. Si le contenu en ADN du tissu à étudier ne se superpose pas à celui du tissu de référence normal, son index d'ADN sera X/1 [ne] 1. Le tissu tumoral sera ADN-aneuploïde (DI [ne] 1).

En raison de l'effectif limité de cette série, une analyse statistique n'a pas pu être effectuée.

RÉSULTATS

Parmi les 23 dossiers des patients énucléés, 3 étaient incomplets et n'ont donc pas pu être exploités. Six dossiers ont été rejetés pour des raisons techniques. En effet, les pièces les plus anciennes avaient été fixées dans du liquide de Bouin altérant le matériel ADN.

L'étude a donc pu être réalisée sur 14 cas (8 hommes, 6 femmes). L'âge moyen était de 74 ans et 6 mois (écart type de ± 17,5 années), le suivi moyen était de 3 ans et 9 mois (écart type de 2 ans 6 mois). Les patients n° 6 et 10 ont bénéficié d'une protonthérapie avant l'énucléation. Cette énucléation a été motivée par une complication de type glaucome néovasculaire et non par une reprise évolutive de la maladie tumorale. La taille tumorale a pu être obtenue pour 12 patients sur 14.

Sur l'analyse histologique standard, parmi ces 14 tumeurs, 3 présentaient un type cellulaire tumoral fusiforme et 11 un type mixte, dont 1 avec une nette prédominance épithélioïde. Une effraction sclérale était présente dans 4 cas. Trois patients ont développé des métastases hépatiques. Les tumeurs étaient de type cellulaire mixte mais 2 d'entre eux comportaient une effraction sclérale.

L'immunomarquage par l'anticorps anti-Ki67 aboutissait à un index de prolifération cellulaire compris entre 0 et 16 % (moyenne de 4,6 % et écart type de 4,4 %). Cet index était nul ou inférieur à 1 % pour 5 tumeurs. Les 3 patients qui ont présenté des métastases hépatiques n'avaient pas un index de prolifération particulièrement élevé.

L'étude en cytométrie de flux montrait que 2 des tumeurs étaient ADN-aneuploïdes (fig. 2a), tandis que 12 étaient ADN-diploïdes (fig. 2b). Les trois patients souffrant d'une maladie métastatique ont présenté une lésion tumorale ADN-diploïde (tableau I).

DISCUSSION

L'interprétation des critères histo-pronostiques des mélanomes choroïdiens est difficile et leur reproductibilité a parfois été remise en question [8], [9]. Les caractéristiques morphologiques de la vascularisation des mélanomes uvéaux sont considérées comme étant des facteurs prédictifs de la progression tumorale [2]. Ainsi la présence de boucles vasculaires et de réseaux soulignés par la coloration par le PAS, sont de mauvais pronostic [2], [10]. Le type cellulaire est un facteur histo-pronostique important pour de nombreux auteurs [3], [4]. Les mélanomes de type fusiforme présentent un faible pourcentage de décès par métastases tandis que les mélanomes mixtes (fusiforme et épithélioïde) ont un pronostic vital plus péjoratif. Une évolution métastatique a été observée pour 3 patients de notre étude qui présentaient une tumeur de type mixte.

L'antigène Ki67 est un antigène nucléaire exprimé par les cellules engagées dans le cycle cellulaire en phase G1, S, G2 et M. Il permet d'estimer l'index de prolifération cellulaire. Selon Frahm et al. , dans les mélanomes malins cutanés superficiels (dont l'épaisseur est inférieure à 1 mm), un index de prolifération élevé (supérieur à 25 %) évalué par l'anticorps anti-Ki67, est corrélé avec l'apparition de métastases précoces [11]. Ce même index est également élevé dans les mélanomes uvéaux métastatiques [12], [13]. Il est corrélé avec l'index mitotique et le plus grand diamètre tumoral, mesuré histologiquement [12]. Il est nettement diminué, voire nul, dans les tumeurs irradiées [12], [13]. L'index de prolifération maximum de nos cas est de 16,7 %. Les deux patients qui ont présenté des métastases ont un index de prolifération peu élevé (5,4 et 6,7 %). Le faible coefficient de prolifération de nos cas pourrait expliquer l'absence de sensibilité de ce test dans la prédiction de l'apparition de métastases dans les mélanomes choroïdiens.

La cytométrie en flux (CMF) permet une mesure du contenu en ADN du noyau des cellules et l'étude du cycle cellulaire [5]. Les cellules normales contiennent 2n chromosomes et sont dites diploïdes. Un contenu en ADN différent de 2n chromosomes est anormal et définit l'aneuploïdie. Une prolifération tumorale peut être diploïde ou aneuploïde. La CMF apporte un élément pronostique dans les tumeurs solides [14]ou dans les thymomes, où la diploïdie est corrélée avec un taux de survie excellent [15], tandis que l'aneuploïdie s'accompagne d'une importante chute de la survie à 5 ans. Dans les mélanomes choroïdiens, les anomalies de la ploïdie montre un intérêt pronostique hétérogène selon les études. Ainsi, Elavathil et al. [16]et Richardson et al. [14]ne mettent pas en évidence de valeur prédictive de la ploidie sur la survie avec un suivi de 5 ans. En revanche, Toti et al. [17]et Mooy et al. [18]montrent une association entre l'aneuploïdie et l'augmentation de la mortalité. Les mélanomes irradiés seraient significativement plus aneuploïdes que les tumeurs non-irradiées [18]. Parmi les 15 cas de notre étude, les 2 cas aneuploïdes n'ont pas présenté de métastases.

CONCLUSION

Il n'a pas été mis en évidence de corrélation entre la ploïdie et l'index de prolifération cellulaire et l'apparition de métastases. Les deux patients qui ont présenté des métastases avaient une effraction sclérale, élément majeur du pronostic (fig. 2). Toutefois, l'évaluation des résultats de notre étude est limitée par le faible nombre de mélanomes choroïdiens analysables histologiquement, notamment du fait d'un traitement heureusement de plus en plus conservateur de cette pathologie [19]. De plus, 5 cas n'ont pas été analysables parmi les plus anciens du fait d'une fixation dans le Bouin nous privant des patients dont le délai de suivi était le plus long. Ceci doit faire souligner la nécessité d'une fixation formolée des pièces d'énucléation afin de permettre une analyse anatomo-pathologique optimale [3]. De plus, la biologie moléculaire avec les techniques de micro-arrays et d'hybridation génomique comparative, permettra ainsi peut être d'affiner nos indicateurs pronostiques, comme le laisse présager l'analyse des transcrits géniques [20].

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