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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 27, N° 10  - décembre 2004
pp. 1141-1145
Doi : JFO-12-2004-27-10-0181-5512-101019-ART08
Apport de l’analyse protéomique associant électrophorèse bi-dimensionnelle et spectrométrie de masse en lacrymologie
À propos d’un cas
 

E. Ballot [1], P. Marcelo [2], V. Labas [2], S. Doan [2], O. Zamfir [1], C. Chaumeil [1], J. Vinh [3], L. Batellier [1]
[1] Laboratoire de Biologie, Centre Hospitalier National d’Ophtalmologie des Quinze-Vingts, Paris, France.
[2] Service d’Ophtalmologie, Hôpital Bichat, Paris, France.
[3] Laboratoire de Neurobiologie et Diversité Cellulaire, École supérieure de Physique-Chimie Industrielles de la Ville de Paris, France.

Présenté en poster et courte communication au 109e congrès de la SFO en mai 2003.


Tirés à part : L. Batellier,

[4] Laboratoire de Biologie, Centre Hospitalier National d’Ophtalmologie des Quinze-Vingts, 28, rue de Charenton, 75571 Paris cedex 12. l.batellier@quinze-vingts.fr

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Apport de l’analyse protéomique associant électrophorèse bi-dimensionnelle et spectrométrie de masse en lacrymologie. À propos d’un cas

But : Identification d’une protéine lacrymale grâce à l’analyse protéomique associant électrophorèse bi-dimensionnelle et spectrométrie de masse.

Matériel et méthode : Nous avons étudié les protéines des larmes d’une patiente de 25 ans, porteuse d’une hyperandrogénie par hyperplasie des surrénales et présentant une conjonctivite papillaire chronique invalidante avec film lacrymal instable et bilan allergologique négatif. L’électrophorèse sur agarose des protéines lacrymales révélait une augmentation bilatérale nette du pic des protéines à migration rapide ou lipocalines.

Résultats : L’électrophorèse des larmes des yeux droit et gauche sur gel de polyacrylamide en présence de dodecyl-sulfate de sodium, montre après coloration au bleu de Coomassie colloïdal, la présence d’une bande intense à 15 kDa comparée à des larmes témoins. En électrophorèse bi-dimensionnelle, cette bande focalise en un spot unique au point isoélectrique 7,0. Après digestion trypsique du spot d’intérêt, l’analyse des cartes peptidiques massiques obtenues par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) permet son identification sans ambiguïté comme étant la cystatine-SN. Dans la glande lacrymale de rat, des protéines homologues aux cystatines humaines ont été rapportées codées par des gènes régulés par les androgènes.

Commentaire et conclusion : L’hyperandrogénie de la patiente peut expliquer l’hypersécrétion de cystatine-SN responsable de l’élévation du pic des protéines à migration rapide. Ce résultat illustre l’intérêt de l’outil protéomique dans le domaine de l’analyse complexe des larmes.

Abstract
Proteomic analysis associating two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry to identify lacrimal proteins: a case study

Purpose: Identification of a lacrimal protein by proteomic analysis, i.e., two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry.

Material and methods: We studied the tears of a 25-year-old female with adrenal gland hyperplasia and hyperandrogenism complaining of chronic dryness and mild bilateral papillary hypertrophy. An allergologic workup was negative. Agarose electrophoresis of the tears showed a bilateral high level of rapid migrated proteins.

Results: Dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis of the tears from both eyes showed a highly stained 15-kDa band after Coomassie colloidal blue coloration compared to controls. On two-dimensional electrophoresis, this band focused on a single spot at pI 7.0.

After tryptic digestion in gel, peptide mass fingerprint analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry provided clear identification of cystatin SN. It is known that mRNA regulated by androgens and encoding glycoproteins homologous to human cystatin exists in the rat lacrimal gland.

Conclusion: We conclude that the hyperandrogenism of the patient may be cause for the hypersecretion of this cystatin SN, giving an explanation for the high level of rapid migrated proteins (lipocalins). This result provides a concrete example of the proteomic tool used to identify lacrimal proteins, still largely unknown.


Mots clés : Électrophorèse des larmes , spectrométrie de masse , cystatine-SN

Keywords: Tear electrophoresis , mass spectrometry , cystatin SN


INTRODUCTION

Les récents progrès en biochimie analytique ont permis de mieux connaître la composition des larmes. L’électrophorèse sur gel d’agarose est la technique électrophorétique la plus utilisée dans la pratique courante d’un laboratoire de biologie ophtalmologique. Le protéinogramme des protéines lacrymales ainsi séparées comprend quatre pics d’intensité variable selon la pathologie [1]. Les trois fractions principales représentent un groupe de protéines d’origine lacrymale : les protéines à migration rapide ou lipocalines, la lactoferrine et le lysozyme. Le quatrième pic, de faible intensité, est plus hétérogène. Ce type d’électrophorèse apporte en routine une aide diagnostique dans les syndromes secs avec une diminution d’une (ou plusieurs) fraction(s) des protéines lacrymales. Dans les syndromes inflammatoires, il existe un passage à travers la barrière hémato-lacrymale des protéines d’origine sérique, en particulier de l’albumine, traduit par l’apparition d’un pic bien individualisée sur le tracé. Cependant, l’intérêt analytique de ce type d’électrophorèse est limité car chaque fraction est un amalgame de nombreuses protéines. L’électrophorèse sur gels de polyacrylamide en présence d’un agent dénaturant et le dodecyl-sulfate de sodium (SDS-PAGE), permettent une meilleure séparation des protéines qui sont fractionnées selon leur poids moléculaire [2]. Enfin, l’électrophorèse bi-dimensionnelle (2D) analyse la composition des larmes en séparant les protéines selon deux caractéristiques physico-chimiques, le point isoélectrique (pI) et le poids moléculaire (PM) [3]. L’électrophorèse 2D est actuellement la technique qui offre la meilleure résolution analytique et permet de connaître les modifications protéiques survenant dans diverses pathologies. Cependant, cette technique est longue et rarement utilisée en lacrymologie [3], [4], [5], [6], [7]. Le développement récent de la spectrométrie de masse en biologie permet d’obtenir une carte peptidique massique pour chaque spot protéique séparé par électrophorèse 2D [8]. La spectrométrie de masse permet d’appréhender le taux d’expression des protéines dans la cellule en tenant compte de leurs modifications post-traductionnelles [9].

Le but de cette étude est, en combinant électrophorèse 2D et spectrométrie de masse, d’identifier quelle protéine est responsable d’une élévation importante d’une des fractions du protéinogramme sur électrophorèse sur agarose, chez une patiente avec une hyperandrogénie sur hyperplasie des glandes surrénales.

PATIENTS ET MÉTHODES
Patient

Une patiente de 25 ans se plaint d’une sensation de sécheresse oculaire chronique et de brûlure depuis l’âge de 15 ans. Il n’y a aucun antécédent personnel ou familial d’atopie. Elle est traitée pour une hyperplasie de la glande surrénale avec une hyperandrogénie modérée depuis un an. Sa symptomatologie oculaire est intense et s’amende partiellement sous larmes artificielles et collyres à la vitamine A. Les collyres corticoïdes et antihistaminiques sont restés sans effet. Elle ne se plaint pas de sécheresse buccale. L’examen clinique ophtalmologique est relativement pauvre, comparé à cette symptomatologie fonctionnelle. L’acuité visuelle est de 20/20e aux deux yeux, il existe une légère hypertrophie papillaire, la cornée et le segment antérieur sont normaux, et il n’y a pas d’inflammation de la glande de Meibomius, ni de blépharite. Le test de Shirmer est à 20 mm à 5 minutes pour les deux yeux. Le marquage au vert de lissamine est négatif et le break-up time normal. L’enquête allergologique est négative : le prick test est négatif pour les pneumallergènes ; les IgE totales dans le sang présentent des valeurs normales et aucune IgE est détectable dans les larmes. Aucun argument clinique ou biologique ne peut laisser présager une maladie de système, en particulier un syndrome de Sjögren. La recherche de Chlamydiae dans les grattages conjonctivaux par culture est négative.

Un taux élevé de protéines est décelé dans les larmes des deux yeux, 13,4 g/l à droite et 15 g/l à gauche, pour une valeur usuelle inférieure à 10 g/l. L’électrophorèse sur agarose montre une augmentation bilatérale de la fraction des protéines à migration rapide (fig. 1), à 6,3 g/l pour l’œil droit, et 7,1 g/l pour le gauche, alors que les valeurs usuelles ne dépassent pas 3,4 g/l. Par ailleurs, le profil électrophorétique n’est pas inflammatoire et l’albumine dosée dans les larmes est inférieure à 50 mg/l.

Dans la suite de cette étude, des échantillons de larmes de quatre donneurs indemnes de pathologie oculaire ont été étudiés en parallèle.

Méthodes

Vingt microlitres de larmes ont été recueillis à l’aide d’une pipette pasteur à l’angle externe des deux yeux, sans stimulation. Elles ont été centrifugées rapidement à 1 000 g pendant 5 minutes pour enlever les débris et un inhibiteur des protéases, le 4-(2-aminoéthyl)-benzensulfonyl-fluoride (à 1 mM), a été ajouté avant congélation à – 80 °C. L’électrophorèse sur agarose a été réalisée avec un appareil Hydrasis (Sebia), les protéines colorées par le noir d’amide et les différentes fractions quantifiées par un intégrateur de coloration, selon les instructions du fabricant.

Les électrophorèses mono-dimensionnelles (1D) SDS-PAGE ont été effectuées sur des gels à 12,5 % de polyacrylamide [10]. 60 mg de protéines lacrymales sont déposés sur chaque piste. Les poids moléculaires ont été calculés à partir d’une courbe établie avec des protéines étalons (Bio-rad, Richmond, CA).

Les électrophorèses 2D sont réalisées dans la première dimension en utilisant des gradients de pH linéaires entre pH3 et pH10, établis par des immobilines couplées de façon covalente à des gels de 11 cm (Amersham Pharmacia Biotech) [11]. 60 mg de protéines lacrymales sont mélangés avec le tampon de réhydratation des gels pendant 12 heures. L’iso-électrofocalisation démarre à 150 V et le voltage est augmenté progressivement jusqu’à atteindre 20 000 V/h. Après l’iso-électrofocalisation, les gels sont incubés avec une solution de SDS supplémentée dans un premier temps avec du dithiothreitol, puis dans un deuxième temps avec de l’iodo-acétamine. Les gels d’iso-électrofocalisation sont alors déposés sur l’extrémité supérieure d’un gel à 12,5 % de polyacrylamide.

Après séparation en électrophorèse 1D SDS-PAGE et électrophorèse 2D, les protéines sont colorées au bleu de Coomassie colloïdal (Sigma).

Sur l’électrophorèse 2D, les spots d’intérêts sont découpés, digérés in situ par la trypsine puis les fragments trypsiques sont co-cristallisés dans une matrice organique, vaporisés et ionisés par un rayonnement laser et le temps de vol des ions moléculaires générés est analysé (spectrométrie de type MALDI-TOF, matrix-assisted-laser-desorbtion/iomization, time of flight) [12], en utilisant un spectromètre Voyager DE STR (Applied Biosystem Inc, Framingham, MA) étalonné en utilisant l’ion [M+H]+ de la bradykinine (PM : 904,46) et de l’ACTH (clip 18-39, PM : 2 465,2). La trypsine et ses produits de protéolyse (PM : 658,39 ; 805,42 ; 1 153,57 ; 2 163,06 ; 2 273,16) sont utilisés comme étalons internes. La recherche dans les banques de données [13] est réalisée avec le logiciel ProFound (Url : click Here) en utilisant les paramètres suivants : recherche chez les mammifères, gamme de PM de 10 à 100 kDa, gamme de pI de 0 à 14, peptides mono-isotopiques. Une absence de deux clivages par la trypsine et une déviation de masse de 50 ppm étaient autorisées. La banque de données non redondante Swiss-Prot a été utilisée. Des modifications partielles des masses des peptides trypsiques comme l’oxydation des méthionines et la carbométhylation des cystéines sont prises en considération.

RÉSULTATS

Afin d’explorer un pic protéique anormalement élevé sur une électrophorèse sur agarose, nous avons dans un premier temps réalisé une électrophorèse 1D de type SDS-PAGE (fig. 2). Les SDS-PAGE des larmes de la patiente montraient une bande de 15 kDa intensément colorée, comparée aux électrophorèses des larmes des témoins.

Sur électrophorèse 2D (fig. 3), cette bande focalisait sous forme d’un spot unique de pI 7,0, intensément coloré comparé aux contrôles, où aucun spot avec ces PM et pI sont observés ou alors avec une très faible intensité.

Les peptides générés par la digestion trypsique du spot d’intérêt étaient analysés par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Les masses des peptides étaient comparées aux masses de peptides résultant de digestions trypsiques théoriques de toutes les séquences protéiques répertoriées pour les mammifères dans les banques. Cette recherche avec le logiciel proFound a permis d’identifier la cystatine-SN.

La valeur de probabilité de 100 %, un pourcentage de recouvrement de 67 %, l’existence sur le spectre de six pics correspondant aux masses de peptides générés spécifiquement par la digestion trypsique (fig. 4) et enfin la concordance pI/PM théorique (6,8/16,57 kDa) avec les pI/PM mesurés (7,0/15 kDa), concourent à une identification certaine.

DISCUSSION

L’outil protéomique que nous avons utilisé dans cette étude a montré que la cystatine-SN semblait être responsable de l’augmentation de la fraction des protéines à migration rapide sur électrophorèse sur agarose des larmes d’une patiente avec une hyperplasie surrénalienne et hyperandrogénie. Les cystatines forment une famille d’enzymes qui protège la cornée des effets nocifs des protéases à cystéine sécrétées par les cellules ou les bactéries [14]. Un des membres de cette famille est la cystatine-SN [15]. Selon Malloy et al. [3], la cystatine-SN est une protéine présente sur la cartographie 2D de larmes normales. Mais la comparaison inter-laboratoires des cartographies 2D de larmes n’est pas facile. Des variations de nombreux paramètres n’en font pas une technique standardisée. La préparation des échantillons, le type de gradient de pH et de gel de première dimension, l’utilisation de gel avec gradient de polyacrylamide ou à concentration constante en polyacrylamide, le pourcentage de polyacrylamide ainsi que le choix du type de coloration des protéines aux sensibilités variables influent sur le résultat final. De plus, sur la cartographie de Malloy et al. [3], les spots n’étaient pas tous identifiés. C’est pourquoi, nous avons choisi d’identifier spots par spectrométrie de masse. Nous avons utilisé une coloration de bleu de Coomassie colloïdal alors que Malloy et al. [3] colorent leurs gels au nitrate d’argent, dix à trente fois plus sensible, expliquant que nous n’avons aucun spot aux PM et pI de la cystatine-SN sur les cartographies de larmes normales. Ces données nous laissent à penser que la cystatine-SN était à un niveau d’expression élevé dans les larmes de la patiente. Il est bien étayé que les androgènes régulent la fonction de la glande de Meibomius à travers la synthèse de lipide entrant dans la constitution du film lipidique assurant la tension interfaciale de la phase aqueuse des larmes [16]. Il n’a cependant pas été observé de meibonite clinique chez cette patiente. Par ailleurs, il a été rapporté qu’il existe dans la glande lacrymale de rat, des ARNm codant pour des glycoprotéines homologues aux cystatines humaines régulées par les androgènes [17], [18]. Ces arguments nous font poser l’hypothèse que le niveau élevé de cystatine responsable de l’augmentation de la fraction des protéines à migration rapide dans les larmes de la patiente pourrait être ainsi lié à son hyperandrogénie. Néanmoins, cette hypothèse est portée suite à l’observation d’un cas isolé. D’autres études seront nécessaires avant de relier ce niveau élevé de cystatine-SN dans les larmes à la symptomatologie oculaire de la patiente.

En conclusion, ce travail fournit surtout un exemple de la potentialité de l’électrophorèse 2D combinée avec la spectrométrie de masse dans le domaine de l’analyse des larmes et du diagnostic en lacrymologie.

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