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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 29, N° 1  - janvier 2006
pp. 11-18
Doi : JFO-01-2006-29-1-0181-5512-101019-200506623
Évaluation in vivo par échographie à très haute fréquence des modifications épithéliales cornéennes induites par un bêta-bloquant avec 0,01 % de chlorure de benzalkonium
 

A. Denoyer [1 et 2], F. Ossant [2], B. Arbeille [3], F. Fetissof [4], F. Patat [2], P.-J. Pisella [1]
[1] Service d’Ophtalmologie, Centre Hospitalo-Universitaire Bretonneau, Tours.
[2] GIP/Ultrasons LUSSI CNRS FRE-2448, Faculté de Médecine de Tours, Tours.
[3] Département de Biologie Cellulaire et Microscopie Électronique, Centre Hospitalo-Universitaire Bretonneau, Tours.
[4] Département d’Anatomopathologie, Centre Hospitalo-Universitaire Bretonneau, Tours.

Tirés à part : P.-J. Pisella,

[5] Service d’Ophtalmologie, CHU Bretonneau, 2, boulevard Tonnellé, 37044 Tours Cedex. pj.pisella@chu-tours.fr

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Évaluation in vivo par échographie à très haute fréquence des modifications épithéliales cornéennes induites par un bêta-bloquant avec 0,01 % de chlorure de benzalkonium

But : Évaluation de l’apport de l’échographie très haute fréquence (ETHF) dans le suivi comparatif in vivo des modifications cornéennes épithéliales induites par une toxicité médicamenteuse locale.

Matériel et méthode : Une solution de timolol contenant 0,01 % de chlorure de benzalkonium (BAC) (Timoptol®) a été instillée deux fois par jour dans l’œil test de 10 lapins pendant deux mois, tandis que l’œil témoin recevait la même solution sans BAC (Timabak®). Nous avons utilisé une ETHF à 60 MHz afin d’évaluer in vivo la toxicité cornéenne du BAC. Cette étude prospective et comparative comportait une évaluation clinique et échographique hebdomadaire ainsi qu’une analyse histologique finale.

Résultats : Les examens cliniques ont mis en évidence une altération de la surface oculaire des cornées exposées au BAC : hyperhémie conjonctivale, kératite et altération du film lacrymal. L’ETHF a révélé une décroissance dans le temps de l’épaisseur épithéliale des cornées exposées au BAC (de 40,9 ± 1,6 µm à J0, à 31,8 ± 3,4 µm à J56 ; p = 0,0006), alors que les cornées non-exposées présentaient une stabilité de l’épaisseur épithéliale. Les mesures quantitatives de l’épaisseur épithéliale cornéenne par ETHF étaient corrélées à l’atteinte cornéenne clinique (à J34 et J56 ; p = 0,0025 et p = 0,0377 respectivement) ainsi qu’aux mesures morphométriques histologiques (p = 0,0176). De plus, l’ETHF a permis la visualisation échographique précoce et in vivo des altérations morphologiques épithéliales induites par le BAC.

Conclusion : L’ETHF a permis un suivi in vivo des modifications épithéliales induites par une exposition chronique à un conservateur. Cette technique d’imagerie in vivo pourrait permettre une évaluation objective, reproductible et précoce de la pathologie toxique de la surface oculaire.

Abstract
In vivo assessment of corneal epithelial toxicity of timolol with benzalkonium chloride using very-high-frequency ultrasound imaging

Purpose: To assess in vivo the corneal epithelial damage caused by a topical toxic medication using a 60-MHz ultrasound device.

Material and methods: A solution of timolol with 0.01% benzalkonium chloride (BAC) was applied twice a day in the test eyes of ten rabbits, and a BAC-free solution of timolol in the control eyes, for 56 days. We used a 60-MHz ultrasound device to evaluate the epithelial damage in BAC-exposed eyes, compared to control eyes. The clinical and ultrasound examinations were performed every week, and the histological analysis at the end of the experiment.

Results: The clinical findings were conjunctival redness, corneal staining and instability of the tear film. In vivo VHF ultrasound revealed a thinning of the epithelium of test eyes (from 40.9±1,6 µm at D0 to 31.8±3.4 µm at D56; p=0.0006 for D0 vs D56), while the epithelium of control eyes remained unchanged. Ultrasound epithelial thickness was correlated with corneal staining (at D34 and D56; p=0.0025 and 0.0377, respectively) and histological epithelial pachymetry (p=0.0176 for control and 0.0505 for tested epithelium). Moreover, we report qualitative VHF ultrasound imaging of early epithelial damage.

Conclusion: This new device could be very useful in ocular toxicity evaluation as a reproducible and reliable tool for multicentric clinical research.


Mots clés : Échographie à très haute fréquence , timolol , chlorure de benzalkonium , conservateur , toxicité , surface oculaire , cornée

Keywords: Very-high-frequency ultrasound , timolol , benzalkonium chloride , preservative , toxicity , ocular surface , cornea


INTRODUCTION

Depuis une quinzaine d’années, le développement de l’échographie à très haute fréquence (ETHF) en ophtalmologie a considérablement amélioré l’imagerie de haute résolution des structures oculaires antérieures [1], [2]. Aujourd’hui, les prototypes d’échographes de fréquence supérieure à 50 MHz peuvent contribuer à l’évaluation de pathologies oculaires comme le glaucome, les sclérites [3], [4] ou les tumeurs antérieures, mais la principale voie de recherche s’articule autour de l’évaluation quantitative du segment antérieur, notamment celle de l’architecture cornéenne [5], [6], [7]. Ainsi l’ETHF peut réaliser des mesures in vivo non seulement de l’épaisseur cornéenne totale, mais aussi de l’épithélium cornéen avec une précision pouvant atteindre le micromètre [6], [7], [8].

Le chlorure de benzalkonium (BAC) constitue un des conservateurs les plus employés, en particulier dans les collyres anti-glaucomateux, en dépit de ses propriétés détergentes et cytotoxiques. Cet ammonium quaternaire déstabilise en partie le film lacrymal, mais altère aussi directement la surface oculaire, entraînant inflammation et métaplasies des cellules cornéennes et conjonctivales [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Ainsi, l’application répétée de BAC conduit à un amincissement épithélial cornéen, puis une rupture de la barrière épithéliale [18] et un œdème stromal. Il existe des méthodes d’évaluation clinique ou ex vivo d’évaluation de la pathologie toxique de la surface oculaire [19], [20], mais peu d’outils permettent une évaluation in vivo qualitative et quantitative de celle-ci [21], [22], [23].

Le but de cette étude est d’une part d’évaluer si la mesure suivie de l’épaisseur épithéliale cornéenne par ETHF constitue un moyen objectif d’évaluation de la toxicité du BAC, et d’autre part d’envisager les capacités de l’ETHF à détecter précocement une altération de la surface oculaire. Pendant deux mois, une solution ophtalmique de timolol avec 0,01 % de BAC a été instillée deux fois par jour dans l’œil test de lapins albinos alors que l’œil contrôle recevait la même solution sans BAC. Nous avons développé une nouvelle ETHF à 60 MHz afin de suivre in vivo les modifications épithéliales induites par cette exposition chronique au BAC. Cette étude prospective de type cas-témoin a comporté un examen clinique et échographique hebdomadaire ainsi qu’une analyse histologique en fin de protocole.

MATÉRIEL ET MÉTHODES
Animaux

Dix lapins albinos mâles de race néo-zélandaise et pesant environ 4 kg, fournis par la Société Harlan (Gannat, France), ont été inclus dans l’étude. Seuls les animaux sains sans anomalie oculaire ont été inclus et hébergés dans l’animalerie de la Faculté de Médecine de Tours. Après 15 jours d’acclimatation, un examen à la lampe à fente a confirmé l’intégrité oculaire avant la première instillation. Toute l’étude a été conduite en suivant les critères de l’ARVO relatifs à l’utilisation animale en recherche ophtalmologique.

Échographe à très haute fréquence

Nous avons utilisé un mono-transducteur à 60 MHz (Resource Center for Medical Transducer Technology, University South California, États-Unis) en niobate de lithium, focalisé à 6,4 mm (pour une célérité de 1 540 m/s) et un f-number (rapport entre la focale et le diamètre) égal à 3. Ce transducteur a été intégré dans une sonde assurant un balayage linéaire de 5,2 mm à 10 Hz (LUSSI/GIP-Ultrasons, Tours, France). L’unité informatique de traitement du signal (LUSSI/GIP-Ultrasons, Tours, France) a réalisé un échantillonnage à 500 MHz sur 12 Bytes assurant une image en temps réel de 256 × 512 pixels, soit 5,2 mm de large par 4,1 mm de profondeur. La résolution du système a été évaluée à 75 µm (– 6 dB) en latéral et à 28 µm (– 6 dB) en axial. Un simple gel de contact à base de hyétellose a servi d’intermédiaire entre le nez de sonde et l’œil. La mesure de l’épaisseur épithéliale a été effectuée par la décomposition du double-écho épithélial sur le signal radiofréquence reçu. L’usage d’un algorithme mathématique d’intercorrélation du signal reçu avec des signaux simulés pour chaque épaisseur a permis d’atteindre une précision de mesure égale à 1 µm.

Protocole expérimental

L’œil test a été désigné aléatoirement pour chaque lapin. Du 1er au 56e jour, une solution de timolol contenant du BAC à 0,01 % (Timoptol®) a été instillée deux fois par jour dans l’œil test (une goutte de 50 µl à 8:00 et 20:00). L’œil contrôle a reçu la même solution sans BAC (Timabak®), à la même fréquence. L’état général des animaux était évalué chaque jour et leur poids chaque semaine. Les examens cliniques et échographiques ont été effectués avant la première instillation (J0) puis à J12, J23, J34, J45 et J56. Ils ont été conduits sous anesthésie générale (mélange gazeux oxygène-isoflurane 1 %) sans que l’opérateur ait connaissance de l’œil ayant reçu le BAC.

Un examen clinique bilatéral à la lampe à fente a été effectué afin d’étudier en particulier les paupières, la conjonctive, la cornée, la chambre antérieure et le cristallin. Les altérations de la surface oculaire ont été évaluées au vert de lissamine selon un score variant de 0 à 6 (0 à 3 pour la conjonctive et pour la cornée ; 0 : pas d’altération, 1 : quelques altérations punctiformes, 2 : altérations punctiformes diffuses, 3 : larges plages altérées). Le break-up time (BUT) a été mesuré grâce à l’emploi de fluorescéine.

Après l’examen clinique, l’examen par ETHF a permis une évaluation quantitative de l’épaisseur cornéenne totale ainsi que de l’épaisseur épithéliale par l’analyse du signal radiofréquence. Puis une ETHF en mode-B a permis l’évaluation qualitative de la surface oculaire ainsi que du segment antérieur.

À J56, les animaux ont été sacrifiés avec une dose létale de penthobarbital en intraveineux, puis chaque œil a été immédiatement prélevé afin d’assurer son intégrité. Chaque cornée a été divisée en trois fragments : le premier a été fixé (paraformaldéhyde, puis résine synthétique), puis débité en coupes de 5 µm colorées en HES ; le second a été congelé, puis débité en coupes de 8 µm colorées au bleu de méthylène ; et le troisième a reçu un traitement adapté à la microscopie électronique. L’épaisseur épithéliale moyenne a été calculée sur les coupes congelées.

Analyse statistique

Les résultats ont été exprimés selon une moyenne ± déviation standard. L’évolution de chaque donnée quantitative a été analysée selon un test de Student apparié avec un p ≪ 0,05 considéré comme significatif. La corrélation entre les différentes données a été réalisée selon le test de corrélation z, avec un p ≪ 0,05 considéré comme significatif.

RÉSULTATS
Résultats cliniques

L’état général et le poids des animaux n’ont pas été influencés par l’expérimentation. La durée moyenne de l’examen clinique et échographique sous anesthésie générale était de 14 ± 4 min pour chaque œil. Les résultats de l’évaluation clinique sont indiqués dans le tableau I.

Pour chacune des données cliniques, nous avons calculé la différence entre l’œil test et l’œil témoin, puis nous avons étudié l’évolution de cette différence tout au long de la période d’expérimentation. Par rapport à J0, il existait une modification significative de l’hyperhémie conjonctivale à J45 et J56 (p = 0,0150 et p = 0,0013 respectivement), des lésions conjonctivales à J34, J45 et J56 (p = 0,0013, p = 0,0001 et p = 0,0020 respectivement), des lésions cornéennes à J34, J45 et J56 (p = 0,0005, p = 0,0093 et p = 0,0021 respectivement) et du BUT à J45 (p = 0,0214). Ainsi, en comparaison avec l’œil contrôle, l’exposition chronique au BAC progressivement conduit à une irritation conjonctivale, une kératite ponctuée superficielle et dans une moindre mesure à une altération du BUT (fig. 1).

Données échographiques quantitatives

Concernant l’épaisseur cornéenne totale, les mesures par ETHF ont révélé une épaisseur cornéenne moyenne de 348,6 ± 3,9 µm pour l’œil test et 345,9 ± 6,3 µm pour l’œil contrôle. Aucune différence statistiquement significative n’est apparue au cours de l’étude (p > 0,05).

La figure 2 représente les variations de l’épaisseur épithéliale mesurée par ETHF tout au long de l’expérimentation. À J0, l’épaisseur épithéliale était de 40,9 ± 1,6 µm pour l’œil test et de 41,2 ± 1,7 µm pour l’œil témoin, sans différence statistiquement significative (p > 0,05). Un amincissement progressif de l’épaisseur épithéliale des yeux tests s’est produit (31,8 ± 3,4 µm à J56) parallèlement à une augmentation de la différence d’épaisseur épithéliale entre les yeux test et les yeux contrôles (de – 0,3 ± 1,9 µm à J0 à – 9,1 ± 2,9 µm à J56). L’analyse statistique a confirmé cette diminution absolue de l’épaisseur des épithélia exposés (p = 0,0106, p = 0,0003, p = 0,0029 et p = 0,0006 pour J0 versus J23, J0 versus J34, J0 versus J45 et J0 versus J56 respectivement), de même que la diminution relative de l’épaisseur des épithélia exposés par rapport aux contrôles (p = 0,0010, p = 0,0029, p = 0,0003 pour J0 versus J34, J0 versus J45 et J0 versus J56 respectivement).

Concernant la corrélation entre les résultats cliniques et échographiques (fig. 3), il existait une corrélation significative négative entre l’altération cornéenne et la mesure comparative de l’épaisseur épithéliale à J34 et J56 (p = 0,0025 et p = 0,0377 respectivement). Aucune corrélation significative entre données cliniques et données échographiques n’a été constatée.

Données échographiques qualitatives

Notre système d’acquisition échographique à très haute fréquence nous a permis d’effectuer une imagerie en temps réel à haute résolution des structures oculaires antérieures comme la conjonctive, la cornée, les muscles oculomoteurs, la sclère, l’iris et les corps ciliaires (fig. 4a et 4b). L’analyse qualitative par ETHF des yeux exposés au BAC a révélé échographiquement des altérations de la surface oculaire, allant de l’infiltration conjonctivale jusqu’aux atteintes épithéliales fines de la cornée (fig. 4c et 4d). Ainsi, par la haute résolution apportée en ETHF, notre système a permis un suivi in vivo des altérations fines de l’épithélium induites par une exposition chronique au BAC.

Résultats histologiques

L’évaluation quantitative de l’épaisseur épithéliale a confirmé l’amincissement de l’épithélium des yeux exposés par rapport aux contrôles (34,1 ± 1,4 µm pour l’œil test versus 43,8 ± 1,9 µm pour l’œil contrôle, p = 0,0001). Il existait une corrélation entre les mesures d’épaisseur épithéliale histologiques et échographiques (p = 0,0176 pour l’épithélium contrôle), mais avec un décalage de 2,8 ± 1,9 µm en faveur de l’histologie par rapport à l’ETHF.

La microscopie optique a révélé des altérations des surfaces oculaires exposées au BAC en comparaison aux surfaces contrôles : inflammation conjonctivale avec infiltrat mononuclé, vasodilatation et hypervascularisation limbique parfois associée à une néovascularisation cornéenne périphérique. Les épithéliums exposés au BAC présentaient une modification structurale incluant une perte de l’adhérence cellulaire ainsi qu’une hyper desquamation conduisant à l’absence des premières couches cellulaires épithéliales (fig. 5a et 5b).

L’analyse par microscopie électronique à balayage a confirmé les altérations cellulaires induites par le BAC en comparaison avec les yeux contrôles : haute densité de cellules en desquamation, perte des liaisons inter-cellulaires et dysplasies voire defects membranaires (fig. 5c). La microscopie électronique à transmission a permis d’affiner l’étude ultrastructurale des lésions cellulaires et a montré une densité élevée de cellules dysplasiques ou apoptotiques présentant une dilatation du reticulum endoplasmique et des mitochondries, une perte des microvillosités ainsi qu’une altération des jonctions intercellulaires (fig. 5d).

DISCUSSION

Depuis les années 1980, de nombreuses études cliniques ont rapporté les dommages oculaires induits par le BAC [9], [10], [11], [13], [14], [17], [24], en conformité avec le test de toxicité oculaire de Draize [19]. Ainsi, les effets surfactant et surtout cytotoxique du BAC conduisent à une altération de la surface oculaire, de manière immédiate ou au long cours selon la durée de l’exposition et la fréquence des instillations [10]. Cette étude a confirmé qu’une exposition chronique, deux fois par jour pendant deux mois, à une solution contenant 0,01 % de BAC conduisait à des signes cliniques d’irritation oculaire : lésions conjonctivales dès le 34e jour et hyperhémie dès le 45e jour, kératite ponctuée dès le 34e jour et rupture précoce du film lacrymal dès le 45e jour d’exposition.

Même s’il existe des procédés d’analyse clinique ou ex vivo de la toxicité oculaire induite, peu de moyens objectifs permettent une évaluation in vivo de l’altération toxique de la surface oculaire [25], [26], [27]. Certaines études ont permis de définir le rôle des empreintes conjonctivales et cornéennes dans l’évaluation des altérations oculaires induites par substances toxiques [13], [28]. Cependant, la technique des empreintes ne permet qu’une approche cellulaire et n’étudie que les couches superficielles des populations cellulaires [29]. D’autres études récentes ont évalué l’intérêt dela microscopie confocale dans l’évaluation de la surface oculaire [21], [22], [23], [27], [30]. La biomicroscopie optique permet une analyse structurale et cellulaire de la surface oculaire, ainsi qu’une évaluation in vivo des dommages toxiques, depuis les lésions épithéliales jusqu’aux modifications stromales et à l’œdème cornéen. D’autres études ont démontré la capacité de l’ETHF à mesurer, voire à cartographier, l’épaisseur cornéenne et épithéliale [5], [8], mais aucune ne s’est encore intéressée à l’évaluation de la pathologie toxique de surface par ETHF.

Nous avons développé un échographe à 60 MHz avec une résolution latérale de 75 µm, axiale de 28 µm et une précision de mesure atteignant 1 µm pour l’épaisseur épithéliale. Ainsi, dans cette étude prospective cas-témoin, l’ETHF a permis une mesure in vivo ainsi qu’un suivi de l’épaisseur épithéliale de la cornée. Nous avons constaté un amincissement progressif de l’épithélium de cornées de lapins exposées à 0,01 % de BAC comparativement à des cornées non exposées au BAC. Ces résultats semblent similaires aux précédentes publications qui montrent un amincissement épithélial secondaire à l’exposition à des substances toxiques, en utilisant une analyse histologique ex vivo ou en biomicroscopie confocale in vivo [22], [27]. Dans cette étude, l’utilisation de l’ETHF a permis une quantification de l’effet toxique temps-dépendant d’une solution à 0,01 % de BAC en mesurant in vivo les variations de l’épaisseur épithéliale cornéenne.

Nous avons aussi rapporté une corrélation entre l’amincissement épithélial échographique et l’augmentation des lésions cornéennes cliniques fixées par le vert de lissamine (dès le 34e jour d’exposition) qui colore les cellules épithéliales altérées [31]. Ainsi, l’exposition au BAC a induit une augmentation de la mort cellulaire conduisant à une perte des cellules épithéliales superficielles et donc un amincissement épithélial, mesuré par ETHF. Certains auteurs ont rapporté l’existence d’une corrélation entre le taux de mort cellulaire et la profondeur de l’atteinte toxique cornéenne [32], [33]. Dans cette étude, l’analyse histologique a confirmé l’augmentation de la densité de cellules apoptotiques ainsi que la perte des couches épithéliales superficielles induites par une exposition chronique au BAC, en comparaison à des cornées non-exposées. De plus, il existait une corrélation entre les mesures d’épaisseur épithéliale échographiques et histologiques, malgré un décalage de mesure. Cet écart constant de mesure entre ETHF et histologie pourrait s’expliquer soit par une surévaluation de la célérité des ultrasons dans la couche épithéliale [34], soit par un amincissement ex vivo de l’épithélium lié à la méthode histologique de cryopréservation.

CONCLUSION

Dans cette étude animale prospective et comparative, nous avons montré que l’ETHF permettait un suivi objectif et reproductible in vivo de l’atteinte toxique de la surface oculaire en mesurant les variations épithéliales cornéennes. Nous avons ainsi mis en évidence un amincissement échographique précoce des épithélia exposés à une faible concentration de BAC deux fois par jour, dès le 23e jour. De plus, cet amincissement épithélial précoce est apparu 11 jours avant les premières altérations cliniques significatives. Cette étude pourrait ainsi justifier l’utilisation de l’ETHF non seulement comme une méthode objective d’évaluation de l’irritation oculaire, mais aussi comme un outil de dépistage précoce des lésions oculaires toxiques sur des yeux exposés cliniquement sains. D’autres études animales et surtout humaines seront nécessaires pour confirmer ou non ces résultats, et ainsi mieux définir la place de l’ETHF in vivo dans l’évaluation de la toxicité oculaire : pourrait-elle être une nouvelle méthode de suivi et de dépistage des premières atteintes de surface en toxicologie oculaire ?

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