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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 29, N° 1  - janvier 2006
pp. 32-36
Doi : JFO-01-2006-29-1-0181-5512-101019-200509158
Effet des nitrites et des nitrates sur les rétines de bœuf in vitro
 

D. Hartani [1], H. Belguendouz [2], H. Guenane [2], L. Chachoua [3], O.Q. Lahlou-Boukoffa [4], C. Touil-Boukoffa [2]
[1] Clinique ophtalmologique, CHU Mustapha, Alger, Algérie.
[2] Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Faculté des Sciences Biologiques, USTHB Bab Ezzouar, Alger, Algérie.
[3] Service d’ophtalmologie, CHU Parnet, Alger, Algérie.
[4] Service d’ophtalmologie, CHU Ibn Rochd, Annaba, Algérie.

Communication affichée lors du 110e congrès de la SFO en mai 2004.


Tirés à part : D. Hartani,

[5] Clinique Ophtalmologique, CHU Mustapha, Alger, Algérie. rik_hartani@yahoo.fr

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Effet des nitrites et des nitrates sur les réttines de bœuf in vitro

Introduction/but : L’uvéite est une inflammation intraoculaire qui forme une des plus sérieuses expressions du syndrome de Behçet. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule exprimant d’importantes propriétés immuno-inflammatoires. Il est synthétisé par les NO synthases (NOS). Dans une étude antérieure, nous avons montré une augmentation de la production du NO endogène dans les uvéites Behçet et celles classées « idiopathiques ». L’objectif de la présente étude est de situer le rôle du monoxyde d’azote (NO) dans la genèse des lésions observées in vivo au niveau de la rétine durant les uvéites et ce, en étudiant l’effet de deux de ses métabolites physiologiquement stables, les nitrites et les nitrates sur les rétines de bœuf in vitro.

Matériel et méthodes : Les rétines étaient issues d’yeux de bœuf fraîchement énucléés. Elles étaient ensuite mises en culture dans du DMEM à 10 % de sérum de veau fœtal en présence des différentes concentrations de nitrites ou de nitrates, pendant 24 heures à 37 °C, en atmosphère humide sous 5 % de CO2. Une étude morphologique et histologique était réalisée.

Résultats : Un effet dose-dépendant pour les deux effecteurs était observé. À partir d’une concentration de 200 µM pour les nitrites et de 250 µM pour les nitrates, un effet toxique et probablement nécrotique était observé, cet effet s’étant traduit par des lésions tissulaires et cellulaires.

Conclusion : Les nitrites et à moindre degré les nitrates, deux métabolites physiologiquement stables du NO, ont un effet délétère sur les rétines en culture. De ce fait, le NO produit au cours des processus inflammatoires des uvéites pourrait être impliqué dans la destruction des rétines in vivo.

Abstract
Effect of nitrites and nitrates on bovine retina in vitro

Background/aim: Uveitis is an endocular inflammation that forms one of the most serious manifestations of Behçet disease. Nitric oxide (NO) is a molecule that expresses important immunoinflammatory properties and is produced by NO synthases (NOS). In previous studies, we showed an elevated production of endogenous NO during Behçet’s and idiopathic uveitis. These results led us to investigate the effect of nitrites (NO2) and nitrates (NO3) (physiologically stable metabolites of NO) on fragments of bovine retina in order to determine the role of nitric oxide (NO) in the genesis of retinal lesions during uveitis.

Material and methods: Retinas were removed from freshly enucleated bovine eyes and cultured in DMEM, 10% CFS in presence of nitrites (NaNO2) or nitrates (NaNO3) at different concentrations. The cultures were processed at 37 °C, 5% CO2 in a humidified chamber. Cultured retinas were observed by inverse microscopy and then fixed in formaldehyde. Histological studies were conducted after H & E staining.

Results: Cultured retina showed alterations when exposed to concentrations of nitrites and nitrates higher than 200 µM and 250 µM, respectively. These alterations were dose-dependent and affected the cellular and tissular structures. Morphological and histological studies suggested that the toxic effect is apoptotic and/or necrotic for both effectors.

Conclusion: Our investigations showed that nitrites and nitrates, two physiologically stable metabolites of NO, have a deleterious effect on cultured retina. NO, produced in inflammatory processes during uveitis may be implicated in the genesis of the retinal lesions observed during the exacerbation phase of the disease


Mots clés : Monoxyde d’azote , uvéite , rétine

Keywords: Nitric oxide , uveitis , retina


INTRODUCTION

L’uvéite est une inflammation intraoculaire dont les causes sont diverses. Elle peut se manifester de manière isolée ou associée à d’autres manifestations d’une maladie infectieuse ou systémique inflammatoire [1]. L’uvéite est une des plus sérieuses expressions du syndrome de Behçet. Cette maladie, endémique dans le bassin méditerranéen et dont l’étiologie est incertaine, est caractérisée par une vascularite multisystémique chronique. Ses signes majeurs sont une aphtose buccale, une ulcération génitale, une uvéite antérieure et/ou postérieure et des lésions cutanées. L’inflammation oculaire est généralement bilatérale. La cécité est retrouvée dans 10 à 20 % des cas. Elle est surtout due à la vascularite rétinienne occlusive (fig. 1), complication qui survient chez 30 à 40 % des patients [2]. Les nombreuses anomalies immunologiques qui ont été observées et qui suggèrent un rôle de l’auto-immunité dans la maladie comportent des réponses immunitaires des cellules T à l’antigène S, protéine soluble de 45 kDa exprimée au niveau des photorécepteurs et qui est utilisée dans l’induction de l’uvéite auto-immune expérimentale (UAE) ; modèle in vivo de l’uvéite humaine [3].

Le monoxyde d’azote (NO) est un gaz lipophile produit par une classe d’enzymes, les NO synthases (NOS). Il diffuse aisément dans les systèmes biologiques. Cette molécule très instable réagit avec l’oxygène moléculaire ou ses dérivés comme l’anion superoxide pour donner respectivement des molécules physiologiquement stables (les nitrites NO2- et les nitrates NO3) ou hautement réactives et cytotoxiques telles que le peroxynitrite ONOO- [4].

NO est produit dans plusieurs systèmes (endothélial, nerveux, immunitaire). Il joue un rôle primordial dans la physiologie oculaire, en particulier dans la régulation du tonus vasculaire, la neurotransmission et l’homéostasie. En revanche, sa production augmente dans plusieurs maladies inflammatoires oculaires. Il joue un rôle dans leur physiopathologie où il exprime d’importantes propriétés inflammatoires [5]. De nombreux travaux sur des modèles animaux ont montré les effets toxiques du NO sur les rétines. En effet, l’injection intraoculaire du NO chez les rats induit la mort des neurones rétiniens estimée par la mesure de l’épaisseur de la rétine [6].

Dans une étude antérieure, nous avons pu mettre en évidence l’augmentation de la production de NO associée à un profil Th1/Th2 chez des patients atteints de la maladie de Behçet et présentant une uvéite active [7]. D’autres travaux ont révélé la présence de quantités significatives de NO dans les larmes des patients atteints de cette affection [8]. La mise en évidence de l’action du NO au niveau de la rétine, variable en fonction du degré de l’inflammation, pourrait constituer un indicateur dans le pronostic et la surveillance des patients atteints de la maladie de Behçet. Ces données nous ont amenés à étudier l’effet du NO, sous forme de nitrites et de nitrates, sur la rétine afin de situer son implication dans l’inflammation locale au niveau de la rétine. Dans cette étude, nous avons mis en évidence, in vitro, les atteintes tissulaires et/ou cellulaires dues à l’action des nitrites et des nitrates, deux métabolites physiologiquement stables du NO.

MATÉRIEL ET MÉTHODES
Extraction des rétines de bœuf

Les yeux de bœufs (n = 100) ont été récupérés à partir d’animaux sains après abattage. La rétine était prélevée de la partie supérieure de l’hémisphère postérieure. Le test de viabilité a été réalisé au bleu Trypan avant chaque culture. Le Bleu de Trypan est un colorant vital qui ne pénètre pas dans les cellules vivantes. Seules les cellules mortes sont perméables au colorant. Elles se colorent en bleu.

Culture des rétines

La rétine extraite a été déposée dans une boîte de culture contenant du DMEM (Sigma) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (Sigma), 100 UI/ml de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine et 4 µM de L-glutamine (Sigma). Des concentrations croissantes de NaNO2 ou de NaNO3 ont été ajoutées aux cultures (0-500 µM). Les cultures ont été incubées pendant 24 heures à 37 C, dans une atmosphère humide, à 5 % de CO2. L’adhérence cellulaire au support a été testée aux premières heures de la culture.

Étude histologique des rétines après culture

Les cultures ont été observées au microscope à phase inversée avant la fixation. Les rétines fixées au formol tamponné à 10 % ont été incluses dans la paraffine et les coupes histologiques colorées à l’Hématéine-Éosine. Elles ont été ensuite observées au microscope photonique.

RÉSULTATS
Étude morphologique de l’action du NO sur les rétines en culture

Après 24 heures d’incubation, les rétines « témoins » présentaient un aspect uniforme du tissu avec des cellules de tailles semblables à l’aspect normal et réfringentes à la lumière (fig. 2).

Effet des nitrites sur les rétines en cultures

Les rétines mises en culture en présence de nitrites à des concentrations inférieures à 150 µM avaient le même aspect que les rétines « témoins » (fig. 2). En présence de doses supérieures ou égales à 150 µM de nitrites, une désorganisation dose-dépendante était observée. Elle se manifestait par des lésions tissulaires, puis cellulaires avec l’apparition de cellules de taille réduite et peu réfringentes à la lumière (fig. 3a). En présence de 450 µM de nitrites, il survenait une destruction totale de la trame tissulaire, une individualisation complète des cellules et la présence de débris cellulaires (fig. 3b).

Effet des nitrates sur les rétines en cultures

Les rétines mises en culture en présence de nitrates à des concentrations inférieures 250 µM présentaient le même aspect que les rétines témoins. En présence de doses supérieures ou égales à 250 µM de nitrates, une désorganisation dose dépendante était observée. Elle se manifestait par des lésions tissulaires, puis cellulaires. Les lésions tissulaires touchaient toutes les couches rétiniennes, et les cellules en périphérie étaient peu réfringentes et se détachaient du tissu (fig. 4a). En présence de 500 µM de nitrates, une destruction totale de la trame tissulaire et une individualisation complète des cellules avec une augmentation de la taille cellulaire et la présence de débris cellulaires étaient constatées (fig. 4b).

Étude histologique de l’action du NO sur les rétines en cultures

L’observation des coupes histologiques des rétines mises en cultures corrobore les observations microscopiques des cultures. Les cultures « témoins » montraient une organisation stratifiée normale retrouvée dans les rétines des cultures en présence de concentrations inférieures à 150 µM en nitrites et de 250 µM en nitrates (fig. 5).

Action des nitrites sur les rétines en cultures

Les rétines mises en culture en présence de 200 µM de NO2– présentaient un détachement au niveau de la couche des cellules bipolaires ainsi que la présence de cellules avec des noyaux plus petits et plus denses que ceux des rétines « témoins » (fig. 6a). Les doses supérieures induisaient une séparation et une fragmentation des différentes couches de la rétine jusqu’à l’individualisation des cellules (fig. 6b).

Action des nitrates sur les rétines en cultures

Les rétines mises en culture en présence de 250 µM de NO3– montraient un début de décollement au niveau de la couche des cellules bipolaires (fig. 7a). À cette concentration, un effet similaire à celui des nitrites à 200 µM était observé. En effet, les doses supérieures induisaient une séparation et une fragmentation des différentes couches de la rétine jusqu’à l’individualisation des cellules (fig. 7b).

DISCUSSION

Nos résultats montrent des lésions rétiniennes dose-dépendantes à partir de 200 µM de NO2– et de 250 µM de NO3. Des concentrations relativement élevées de NO2– (200-350 µM) et de NO3 (250-400 µM) induisent des lésions tissulaires avec conservation de l’intégrité cellulaire. Les noyaux de ces cellules sont petits et denses. Ces signes sont en faveur d’un effet pro-apoptotique probable du NO [9]. Les concentrations supérieures à 350 µM de NO2 et de 400 µM de NO3– provoquent une destruction tissulaire complète avec une apparition de débris cellulaires. Cet effet nécrotique serait dû à l’inhibition de la cytochrome C oxydase par le NO générant l’anion superoxide. L’interaction de ce dernier avec le NO donne naissance au peroxynitrite, molécule extrêmement cytotoxique [10]. La différence des effets entre les deux métabolites du NO pourrait s’expliquer par le degré de réactivité plus important de NO2en comparaison au NO3–.

Le NO est produit durant les réponses immunitaires par la NOS2. Cette enzyme est exprimée par le système monocyte/macrophage dans les systèmes humain et murin, mais également par certaines cellules locales de la rétine. Elle est induite par de nombreux stimuli tels que les lipopolysaccharides et les cytokines dont l’IFN γ et le TNFα. Les patients atteints d’uvéite présentent une augmentation significative de ces deux [11], ainsi qu’une augmentation des taux sériques du NO sous forme de nitrites et de nitrates. Par ailleurs, plusieurs auteurs ont rapporté le rôle pathologique de NO dans l’inflammation oculaire lors de l’UAE (Uvéite Auto-immune Expérimentale) [12], [13]. Ce rôle est soutenu par la diminution de l’infiltration cellulaire et de la destruction tissulaire au cours de l’UAE chez les souris n’exprimant pas le gène de la NOS2 [14]. Ces données indiqueraient une implication probable du NO dans les processus inflammatoires retrouvés chez les patients atteints d’uvéite.

Les résultats de cette étude corroborent ceux obtenus in vivo et indiquent que la production locale de NO, principalement due aux macrophages infiltrant la rétine [15] et à moindre degré aux cellules locales (microglie et cellules de Müller) [16], serait responsable en grande partie des lésions rétiniennes observées lors des uvéites. Les taux sériques de NO chez les patients atteints d’uvéite varient selon les études. Nos travaux ont montré des taux très élevés (512 ± 67,88 µM) de nitrites et de nitrates chez les patients atteints d’uvéite idiopathique ou d’uvéite « Behçet » en phase active [17]. Ces taux sont plus élevés que les concentrations seuil observées in vitro. Le NO sérique pourrait également induire des lésions locales au niveau de la rétine par diffusion notamment autour des vaisseaux sanguins. Chez certains sujets, les taux de NO retrouvés au niveau des larmes sont également supérieurs à nos concentrations seuil [8]. Nos investigations montrent que le NO, sous forme de nitrites et à moindre degré de nitrates, a un effet toxique sur le plan tissulaire et cellulaire sur les rétines en culture.

CONCLUSION

Cette étude souligne les effets importants et délétères d’une exposition prolongée de la rétine aux nitrites et aux nitrates, deux métabolites physiologiquement stables du NO. Nos résultats confortent l’hypothèse l’implication de la production du NO dans les désordres lésionnels observés lors des uvéites.

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