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Journal Français d'Ophtalmologie
Vol 30, N° 8  - octobre 2007
pp. 807-813
Doi : JFO-10-2007-30-8-0181-5512-101019-200704847
Stabilité à – 20 °C des collyres antibiotiques renforcés (amikacine, ceftazidime, vancomycine)
 

V. Chédru-Legros [1], M. Fines-Guyon [2], A. Chérel [1], A. Perdriel [1], F. Albessard [3], D. Debruyne [3], F. Mouriaux [4]
[1] Pharmacie Hospitalière, Centre Hospitalier Universitaire, Caen.
[2] Service de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire, Caen.
[3] Service de Pharmacologie, Centre Hospitalier Universitaire, Caen.
[4] Service d’Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire, Caen.

Tirés à part : V. Chédru-Legros,

[5] Pharmacie Hospitalière, CHU de Caen, avenue de la Côte de Nacre, 14033 Caen CEDEX. chedru-v@chu-caen.fr

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Stabilité à – 20 °C des collyres antibiotiques renforcés (amikacine, ceftazidime, vancomycine)

Introduction : La kératite bactérienne nécessite un traitement d’urgence par un ou des collyres antibiotiques renforcés. Cependant la disponibilité de ce type de collyre pose problème car ils sont habituellement préparés de façon extemporanée à la demande. Notre objectif est de mettre en place et de valider une fabrication de « masse » par la pharmacie, conforme aux Bonnes Pratiques de Préparations, et de limiter les contraintes organisationnelles.

Matériels et méthodes : Trois antibiotiques ont été retenus : ceftazidime à 5 % (50 mg/ml), amikacine à 5 % (50 mg/ml) et vancomycine à 5 % (50 mg/ml). Les collyres ont été préparés en salle blanche, puis stockés à – 20 °C pendant 75 jours. Durant cette période, des contrôles physico-chimiques, pharmacologiques et bactériologiques ont été réalisés.

Résultats : L’utilisation de ceftazidime à 5 % dans du chlorure de sodium à 0,9 %, de l’amikacine à 5 % dans du chlorure de sodium à 0,9 % et de la vancomycine dans du glucose à 5 % permettent d’obtenir un pH respectivement de 6,47, de 6,51 et de 3,77 et une osmolalité respectivement de 488 mOsm/L, de 367 mOsm/L et de 351 mOsm/L, valeurs acceptables pour la tolérance oculaire. Au cours des 75 jours, aucune diminution significative des concentrations d’amikacine, de ceftazidime et de vancomycine à – 20 °C n’a été notée. Tous les collyres étaient stériles du jour de la fabrication jusqu’au 75e jour.

Conclusion : Cette étude montre que la fabrication de « masse » de collyres renforcés congelés à – 20 °C sur une période de 75 jours est possible pour l’amikacine, la vancomycine et la ceftazidime. Après dispensation, ils doivent être stockés à 4 °C et utilisés dans les trois jours.

Abstract
Fortified antibiotic (vancomycin, amikacin and ceftazidime) eye drop stability assessment at –20 °C

Introduction: Fortified antibiotic ophthalmic solutions are regularly administered as an immediate treatment for bacterial keratitis. Fortified antibiotics used to be self-prepared by nurses. To solve this problem, pharmacy staff studied the stability of three 5% solutions of vancomycin, amikacin, and ceftazidime prepared in aseptic conditions from parenteral antibiotic solutions.

Material and methods: Solutions were frozen at –20 °C. Each solution were examined before storage and over a 75-day period. Ceftazidime and amikacin were diluted in 0.9% sodium chloride and vancomycin in 5% dextrose. Over a 75-day period, physical and pharmacological (absorbance spectra) properties and the sterility of each stock solution were studied.

Results: The pH of amikacin (6.51), ceftazidime (6.47), and vancomycin (3.77) remained stable during the 75-day period. Osmolarities also remained stable (367, 488, and 351 mOsm/L, respectively). There were no significant differences in the concentration, osmolarity, and pH of the three antibiotic solutions before storage and after 75 days of freezing. Over a 75-day period, the stability of amikacin, ceftazidime, and vancomycin remained constant; no contamination was detected before storage and after 75 days.

Conclusion: Topical fortified antibiotic solutions can be stored for 75 days at –20 °C (15 days quarantine). After this time, these eye-drops should be stored at 4 °C and should be discarded after 3 days.


Mots clés : Collyre , antibiotique , préparation pharmaceutique , stabilité , congélation

Keywords: Ophthalmic solution , antibiotics , pharmaceutical preparations , stability , freezing


Introduction

La kératite bactérienne (ou abcès de cornée) est une urgence thérapeutique. Une prise en charge précoce permet de limiter ou d’éviter la survenue de complications graves, sources de séquelles visuelles définitives. On dénombre environ 5 000 cas annuels en France [1]. L’utilisation très largement répandue des lentilles de contact explique la fréquence croissante des kératites bactériennes. Un très grand nombre de bactéries peuvent provoquer une kératite. Les staphylocoques, les streptocoques, Pseudomonas aeruginosa et les entérobactéries sont à l’origine de 90 % des kératites bactériennes. L’analyse en lampe à fente permet de confirmer le diagnostic, voire d’orienter vers un germe spécifique, d’identifier les facteurs de risque en cause et d’apprécier la gravité de l’infection. Tous ces éléments sont à prendre en considération dans l’attitude thérapeutique. En cas de kératite bactérienne sans facteur de gravité, un traitement par une bithérapie topique empirique utilisant des collyres commerciaux suffit. En cas de kératite bactérienne avec des critères de gravité (taille supérieure à 3 mm, central, Tyndall +, précipités rétrodescemétiques…), une hospitalisation avec prescription de collyres renforcés est indispensable [2], [3]. Ces collyres sont fabriqués de façon extemporanée, en zone à atmosphère contrôlée, sur prescription nominative, par les pharmacies hospitalières à partir des antibiotiques destinés à l’usage systémique. Leur conservation est en moyenne de 3 à 4 jours à 4 °C, car dans bien d’autres hôpitaux, les conservations peuvent aller de 7 à plus de 30 jours selon les excipients utilisés, notamment pour la vancomycine.

En pratique nous sommes confrontés à l’impossibilité de produire ces collyres le soir et le week-end, et à des difficultés organisationnelles. Nous avons donc cherché à mettre en place un système garantissant une disponibilité permanente des collyres. Une production de masse des collyres renforcés suivie d’une congélation à – 20 °C nous semble opportune. Les objectifs de ce travail sont de mettre en place et de valider une fabrication conforme aux « Bonnes Pratiques de Préparation à l’Hôpital » de collyres renforcés congelés stables et efficaces pendant une période de 75 jours [4], cette durée correspondant à une péremption de deux mois après la levée de la quarantaine (mise à l’écart de 15 jours, dans l’attente des résultats des contrôles de stabilité).

Matériel et méthodes
Choix des collyres renforcés

L’analyse des 71 cas de kératite bactérienne hospitalisés dans le service d’ophtalmologie sur une période de 2 ans (octobre 2004 à octobre 2006) et pour lesquelles nous disposions d’un antibiogramme, a montré la prépondérance nette des cocci à Gram + (44 cas), suivis des bacilles à Gram – (21 cas), des cocci à Gram – (4 cas), et d’autres divers germes (3 cas). Au vu des antibiogrammes, nous avons choisi pour notre étude trois antibiotiques renforcés : la vancomycine, active sur les bactéries à Gram +, la ceftazidime active sur les entérobactéries et sur Pseudomonas aeruginosa, et l’amikacine, aminoside à large spectre, active notamment sur les bacilles à Gram +. La concentration à 50 mg/ml pour chaque antibiotique est conforme au dosage proposé par d’autres équipes [3], [5], [6].

Procédé de fabrication

Les collyres renforcés ont été préparés sous hotte à flux d’air laminaire horizontale (classe ISO 5) dans une salle blanche. Les spécialités injectables ont été mises en solution : Amiklin® 500 mg poudre injectable (Bristol-Myers Squibb), Fortum® 1 000 mg poudre injectable (GlaxoSmithKline) et Vancomycine® 500 mg poudre injectable (Dakota Pharm) dans une poche de solvant (Ecoflac® de chlorure de sodium 0,9 % ou de glucose 5 % (BBraun). Les solutions ont fait l’objet d’une filtration stérilisante (filtre Millipore® 0,22 µm). Les spécialités injectables ont été utilisées plutôt que les matières premières en poudre car ces dernières sont vendues non stériles. Aucun conservateur n’a été ajouté car, d’une part, la Pharmacopée européenne n’y oblige pas si le principe actif est doté d’activité antimicrobienne et, d’autre part, il a été montré qu’il n’y avait pas de contamination après 4 semaines de stockage à 4 °C de collyres antibiotiques renforcés sans conservateur [5]. Les conservateurs tels que le chlorure de benzalkonium ou encore le thiomersal peuvent provoquer des réactions allergiques parfois intenses [7]. Leur présence fréquente dans les préparations ophtalmiques actuelles augmente le risque de sensibilisation et en cas d’allergie avérée à l’un de ces composants, les choix thérapeutiques sont alors amoindris. De plus, de nombreuses études montrent la toxicité de tels conservateurs pour la surface oculaire : ils risquent en effet à terme de favoriser des érosions de la cornée [8]. Il a été démontré que les collyres sans conservateur permettent une réduction significative des effets indésirables oculaires [9]. Les collyres ont été conditionnés en flacons en verre blanc de type I (verre « neutre » car il est sans influence sur le pH des liquides en contact) de 20 ml munis d’un bouchon souple compte-gouttes (Verrerie Flaconnage Agussol), puis stockés au congélateur à – 20 °C, pendant 75 jours à l’abri de la lumière. Ils ont été décongelés au fur et à mesure de l’étude par mise à température ambiante pendant 30 minutes.

Étude de stabilité

Durant cette période, les contrôles de stabilité physique, chimique (dosages en antibiotique) et un test de stérilité ont été réalisés sur les collyres antibiotiques renforcés à intervalles réguliers et en trois points statistiques : à J0, J7, J14, J28, J45, J60 et J75 (sauf pour les contrôles physiques qui n’ont été réalisés qu’à J0 et J75). Les collyres ont été testés à l’abri de la lumière car la lumière augmente le risque de dégradation des principes actifs. Toutes les analyses ont été réalisées en triplicate, et l’analyse de variance a permis de vérifier si les valeurs obtenues aux différents temps étaient statistiquement différentes (limite de significativité 5 %).

L’étude de stabilité physique a évalué les propriétés physiques initiales telles que l’aspect de la solution, son pH et son osmolalité, qui doivent être maintenues au cours du temps. L’osmolalité d’une solution est la mesure du nombre de moles de soluté par litre de solvant. Trois solvants ont été comparés (chlorure de sodium 0,9 %, Glucose 5 %, ou BSS), ce qui a permis de définir à J0 celui qui est le plus approprié pour la fabrication, la conservation du collyre et pour son application sur l’œil. L’amikacine, la ceftazidime et la vancomycine ont été stables dans le chlorure de sodium 0,9 % ou le glucose 5 % [10]. Le pH et l’osmolalité des solutions ont été mesurés respectivement avec un pHmètre (PHM210 Standard pHMeter MeterLab®) et avec un osmomètre (Osmometer Automatic Roebling®).

L’étude de stabilité chimique a évalué la conservation de l’intégrité chimique et de la teneur déclarée de chaque principe actif, qui doivent être maintenues au cours du temps. La concentration des solutions en antibiotique a été déterminée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) (colonne Merck RP Select B 150 x 4,6 mm, phase mobile KH2PO4 0,05 M/acétonitrile (V/V : 91/9), débit 2 ml/min, λ = 255 nm) pour les collyres à la vancomycine et à la ceftazidime. La méthode utilisée pour le dosage de l’amikacine a été l’immuno-enzymologie (appareil FLX®, Abbott). À chaque date, les dosages ont compris une vérification de l’identification du principe actif par comparaison des temps de rétention des composés présents dans les solutions « témoin » des antibiotiques et ceux des solutions à examiner, et une détermination de la concentration en antibiotique des solutions.

Étude de stérilité

Les collyres doivent être stériles. La stérilité est l’absence de microorganismes viables dans les échantillons pendant toute la période de l’étude. La réalisation d’essais ne suffit pas à garantir la stérilité d’un produit, et l’assurance de la stérilité passe aussi par l’application de procédés de production et de contrôles validés, d’un personnel qualifié et de locaux adéquats. Le test de stérilité choisi a fait appel à la méthode de la Pharmacopée européenne, la filtration sur membrane [11]. Les souches de germes utilisés pour ce test étaient Staphylococcus aureus ATCC 29213 pour la vancomycine, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pour la ceftazidime et Escherichia coli ATCC 25922 pour l’amikacine. La filtration a été réalisée grâce à une membrane en PVDF hydrophile (fluorure de polyvinylidène), matériau à faible adsorption des antibiotiques et d’épaisseur fine (100 µm) de façon à ne pas piéger des résidus inhibiteurs à l’intérieur de la structure de la membrane au cours de la filtration (plus une membrane est fine, plus le risque d’adsorption est réduit). La taille de pores choisie est de 0,45 µm car elle retient suffisamment les microorganismes tout en permettant un débit de filtration élevé sous vide. La membrane que nous avons utilisée est spécialement conçue pour pouvoir tester la stérilité de solutions contenant des inhibiteurs de la croissance microbienne (référence TTHV AB2 10, Millipore). Dans le cas du test de stérilité des solutions antimicrobiennes, afin de se placer dans les conditions les plus favorables à une croissance bactérienne, la Pharmacopée Européenne recommande de rincer au moins 3 fois le filtre avec un volume d’eau pour préparations injectables (EPPI) au moins équivalent au volume de l’échantillon de collyre (5 ml). Ce rinçage vise à éliminer toute trace d’antibiotique sur le filtre qui va être mis en culture et éviter que l’anti-infectieux n’interfère avec la pousse d’éventuels germes contaminant le collyre au moment de sa fabrication [11]. Cependant, la Pharmacopée n’a pas prévu les modalités de ce test pour les solutions concentrées d’antibiotiques : quel volume d’EPPI permet d’éliminer toute trace d’antibiotique ? Nous avons donc cherché à déterminer ces volumes pour les trois antibiotiques. Après le rinçage, la membrane est mise en culture (bouillon trypticase soja) avec un inoculum de 10 à 100 UFC/ml. Les espèces bactériennes ont été choisies en fonction du spectre d’activité de l’antibiotique, ce sont les mêmes que celles choisies pour le test de stérilité : Staphylococcus aureus ATCC 29213 pour la vancomycine, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pour la ceftazidime et Escherichia coli ATCC 25922 pour l’amikacine. Un test de croissance a été réalisé en parallèle utilisant un témoin positif, c’est-à-dire de la gélose ensemencée avec des germes mais sans le collyre antibiotique. Une première lecture des résultats a été effectuée 3 jours après incubation des milieux à 30 °C, puis au bout de 15 jours [12].

Résultats
Étude de stabilité physique

Le principe d’une antibiothérapie superficielle (surtout pour les antibiotiques bactéricides temps dépendants) est d’obtenir des concentrations efficaces supérieures aux concentrations minimales inhibitrices et inférieures aux concentrations toxiques pendant un temps de contact maximal qui dépend de la viscosité, du pH, de l’osmolalité, du type de molécule et des adjuvants contenus dans la préparation. Dans cette étude, le pH et l’osmolalité des solutions ont été mesurés à J0 et J75 (tableau I). Les pH étaient en moyenne de 6,47 pour l’amikacine et de 6,50 pour la ceftazidime. Le pH de la vancomycine était plus bas avec une moyenne de 4,50. Les résultats de l’osmolalité sont présentés dans le tableau II. Les pH des antibiotiques dilués dans le BSS étaient plus favorables pour l’œil que ceux dilués dans le chlorure de sodium. Toutefois, le chlorure de sodium et le glucose étant de manipulation plus facile pour une fabrication en série (il existe en poche de 500 ml et 1 000 ml en vue de préparer une solution mère), nous avons donc retenu comme solvants pour l’étude de stabilité chimique, le chlorure de sodium pour l’amikacine et la ceftazidime, et le glucose pour la vancomycine (du fait de sa stabilité au cours du temps meilleure dans ce soluté à + 4 °C) (communication personnelle). Enfin, la variation de pH entre J0 et J75 était inférieure à 5 % pour l’amikacine et la ceftazidime dans le chlorure de sodium et pour la vancomycine dans le glucose alors qu’elle était supérieure à 5 % pour l’amikacine et la ceftazidime dans le glucose et pour la vancomycine dans le chlorure de sodium.

Étude de stabilité chimique

Une valeur comprise entre 45 et 55 mg/ml (deux déviations standard de 5 %) signifie que le principe actif est stable. À J75, la perte en principe actif était inférieure à 5 % pour les collyres congelés d’amikacine, ceftazidime et vancomycine (tableau III). La déviation standard de la répétabilité des dosages (différence entre trois dosages répétés du même échantillon de collyre et réalisés dans les mêmes conditions) était de 2,5 % pour la ceftazidime, de 7,6 % pour l’amikacine et de 2,8 % pour la vancomycine. Les valeurs des mesures répétées étaient donc concordantes.

Étude de stérilité

Lors de l’étude de validation du test de neutralisation, un trouble du milieu de culture dû à une croissance microbienne est observé, identique à celle du témoin positif, montrant que l’activité antimicrobienne des antibiotiques est complètement éliminée. Les volumes d’EPPI nécessaires pour le rinçage du filtre, afin d’éliminer toute trace d’antibiotique qui pourrait inhiber la croissance d’éventuel germe, étaient de 300 ml pour la vancomycine, de 500 ml pour la ceftazidime et de 750 ml pour l’amikacine. En dessous de ces volumes, aucun trouble n’a été observé, ce qui signifie que l’inoculum bactérien ne poussait pas. Aucun trouble n’a été observé le jour de la fabrication, et à J0, J3, J7, J14, J21, J28, J60 et J75, montrant que tous les collyres étaient stériles (tableau IV). Enfin, les collyres d’amikacine, de ceftazidime et de vancomycine à 5 % sont restés stériles après décongélation, suivi de 4 jours de simulation d’utilisation.

La péremption des collyres d’amikacine, de ceftazidime et de vancomycine à 5 % a donc été fixée à 75 jours à – 20 °C, c’est-à-dire 15 jours de quarantaine, en attente des résultats des contrôles de la préparation et 2 mois de congélation, pendant lesquels les collyres sont prêts à être dispensés.

Discussion

Dans les affections bactériennes de l’œil et de ses annexes, le plus important est d’affirmer la nature microbienne de l’affection et sa gravité. Devant une kératite bactérienne, l’antibiothérapie est indispensable et doit être débutée après les prélèvements bactériologiques en associant deux ou trois antibiotiques. Les collyres renforcés sont indispensables en cas de kératite sévère. Ils permettent d’obtenir de fortes concentrations cornéennes d’antibiotiques. Cependant, leur toxicité locale existe et peut être liée au pH ou à l’osmolarité (l’œil tolère des variations de pH allant de 3 à 10 et supporte sans douleur et sans dommage cellulaire des valeurs de pression osmotique variant de 240 à 550 mOsm/L) et induit très souvent des irritations [13]. Les collyres renforcés peuvent provoquer une sensation de brûlure ou un prurit. Dans notre pratique, cette toxicité est rare puisque les collyres renforcés ne sont utilisés que pendant quelques jours et sont ensuite remplacés par des collyres commerciaux, adaptés à l’antibiogramme ou probabilistes. Les antibiotiques par voie générale sont prescrits uniquement en cas de perforation imminente ou avérée, en cas de sclérite ou endophtalmie ou si le germe identifié est un gonocoque [2]. Les staphylocoques, streptocoques, Pseudomonas aeruginosa et entérobactéries sont à l’origine de 90 % des kératites bactériennes [1]. La vancomycine est l’antibiotique de choix pour les infections à Gram +. La ceftazidime est efficace sur les entérobatéries, même lorsque celles-ci sont porteuses de pénicillinases de bas, voire de haut niveau, à l’exception des germes porteurs de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE). Cette molécule est également active contre Pseudomonas aeruginosa, notamment sur les souches résistantes à la ticarcilline, de plus en plus nombreuses. L’amikacine est un meilleur anti-Gram – que la gentamicine [14]. En revanche, ces antibiotiques ne couvrent pas les infections à anaérobies, ni les infections fongiques. Nous avons utilisé un dosage à 5 % qui correspond à notre pratique quotidienne et qui est en concordance avec la littérature [3], [5], [6], [14]. L’utilisation d’un dosage à 2,5 % peut être discutée. Il n’y a pas de raison qu’un dosage à 2,5 % ait une cinétique de dégradation différente.

Nous avons opté pour une congélation des collyres au lieu d’une réfrigération. Les collyres renforcés peuvent être gardés jusqu’à 1 mois au réfrigérateur avec une stabilité chimique et physique [15], [16], [17], [18]. Toutefois certaines bactéries, psychrophiles, ont une température optimale de développement voisine de 0 °C. Largement répandues dans l’environnement (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Aeromonas, Cytophaga, etc.), elles peuvent contaminer et altérer gravement les aliments et divers autres produits, même conservés au froid. La réfrigération ne fait que ralentir la multiplication des germes, alors que la congélation (– 20 °C) arrête toute multiplication, la transformation de l’eau en glace limitant la quantité d’eau disponible pour ces micro organismes. Nous avons donc choisi de congeler les collyres, décision renforcée par les résultats que nous avions observés lors d’une précédente étude, montrant une perte de concentration entre 4-8 °C de la solution de ceftazidime à J60 et un précipité de la vancomycine dès J14 dans du glucose 5 % (communication personnelle). Dans notre étude, sur la période étudiée de 75 jours, aucune variation significative des concentrations d’amikacine, de ceftazidime et de vancomycine n’a été observée lorsque les collyres étaient conservés congelés à – 20 °C. À notre connaissance, il s’agit de la première étude de validation de péremption aussi longue pour la ceftazidime et l’amikacine, grâce à la congélation. À – 20 °C, deux études ont montré la stabilité des collyres de vancomycine à 2,5 % pendant 28 jours et pendant 3 mois [19], [20]. Heng et al. [21] ont congelé des solutions de ceftazidime et de vancomycine toutes les deux à 5 % dans du chlorure de sodium et ont validé la stabilité de ces deux présentations à 30 jours à – 20 °C, puis à 4 jours à + 4 °C après décongélation. Dans ces études, l’osmolalité des solutions des principes actifs isolés se situait autour de 50 mOsm/L car les antibiotiques étaient dilués dans de l’eau stérile. Dans notre étude, les osmolalités des collyres sont d’environ 300 mOsm/L, donc plus physiologique, car le chlorure de sodium et le glucose ont une osmolalité respective de 308 mOsm/L et de 278 mOsm/L qui s’ajoute à celle des antibiotiques. Pour le patient ambulatoire, la stérilité de ce collyre sans conservateur a été validée pour 4 jours de conservation au réfrigérateur à condition que le patient ne mette pas le bouchon tétine du flacon en contact avec son œil. Au delà, même si le collyre reste stable chimiquement, la stérilité du flacon une fois ouvert n’est plus maîtrisée.

Le choix des tests dans notre méthodologie a été guidé par la spécificité de fabrication d’un collyre et par le matériel et les méthodes dont nous disposions. L’essai défini par la Pharmacopée européenne pour les collyres est basé sur la taille des particules, dont nous nous sommes affranchis dans cette étude car les solutions étaient filtrées à 0,22 µm [11]. La filtration sur membrane est la technique de choix pour l’essai de stérilité, alors que la méthode par ensemencement direct reste peu utilisée en raison de sa faible sensibilité [22]. Nous avons choisi de faire précéder l’étude de stabilité par la détermination des volumes d’EPPI pour éliminer toute trace d’antibiotique, conformément à la Pharmacopée, ces traces d’antibiotique pouvant interférer avec la pousse de germes contaminant le collyre. Lorsque les volumes de rinçage sont inférieurs à ceux définis dans notre étude, l’inoculum bactérien mis en contact avec la membrane de rinçage du collyre ne pousse pas dans le milieu de culture, certainement du fait de l’effet bactéricide de l’antibiotique resté sur le filtre. Seules trois souches de germes ont été testées au lieu des six recommandées par la Pharmacopée pour évaluer si l’activité microbienne a bien été éliminée par le rinçage car les trois germes choisis présentent une grande sensibilité vis-à-vis des antibiotiques de notre étude, contrairement aux garmes anaérobies et aux levures et moisissures. Les méthodes utilisées pour la quantification des antibiotiques sont les méthodes couramment utilisées dans le laboratoire pour le suivi thérapeutique pharmacologique. Elles correspondent à une méthode d’immunoenzymologie pour l’amikacine et deux méthodes spécifiques d’HPLC pour la ceftazidime et la vancomycine. Les méthodes de dosage par HPLC présentent l’avantage par rapport aux méthodes UV et à l’immunopolarisation de fluorescence de séparer les principes actifs de leurs produits de dégradation : lorsque les produits de dégradation sont inactifs sur les germes, les concentrations minimales inhibitrices risquent d’augmenter. Barbault et al. [17] ont dosé les produits de dégradation de la vancomycine par HPLC en phase inverse, avec une détection en ultraviolet : à + 25 °C, ils ont observé une baisse des concentrations du collyre, significative dès le 3e jour, qui s’est accompagnée d’une augmentation significative à J7 dans le collyre de vancomycine du pourcentage de produit de dégradation dépourvue d’activité antibiotique (les CDP1). À + 4 °C, une diminution significative des concentrations de vancomycine (p ≪ 0,1) était apparue à J32. La vancomycine subit donc une dégradation lente et progressive à la chaleur, et peut-être aussi à basse température au cours du temps. Dans notre étude, les produits de dégradation de la ceftazidime et de la vancomycine n’ont pas été dosés car aucun autre pic correspondant aux produits de dégradation n’a été observé. Par ailleurs, la pureté des échantillons a été contrôlée par barrette d’iode. En ce qui concerne l’amikacine, la méthode d’immunoenzymologie utilisée n’est malheureusement pas une méthode d’analyse permettant de séparer le principe actif de ses métabolites ; à défaut d’une autre méthode, nous n’avons donc pas pu les doser.

Le test de stérilité doit être réalisé dans des conditions aseptiques (sous poste de sécurité microbiologique de type II). Il comporte un risque de contamination accidentelle : certains tests de lots que nous avons fabriqués étaient « positifs » ; mais on ne peut dire s’il s’agissait de lots contaminés ou de faux-positifs liés à une contamination pendant le test. Le test de neutralisation de l’effet antibiotique qui précède le test de stérilité est un test long à réaliser et il n’est pas toujours appliqué par les équipes. Défini par la Pharmacopée, il permet de réaliser le test de stérilité dans les conditions les plus défavorables, en éliminant toute trace d’antibiotique qui resterait dans le filtre suite à la filtration du collyre. Ing et al. [22] ont mis au point un test de stérilité par filtration sur membrane, rapide et peu coûteux, qui utilise des consommables couramment disponibles en milieu hospitalier (seringues, filtre 0,45 µm, rampe de filtration sous vide et pompe péristaltique). Le coût du matériel consommable est inférieur à celui de notre technique (10 e au lieu de 20 €). Cependant, dans notre méthode, le rinçage du filtre et l’ajout des milieux de culture s’effectuent en circuit fermé, sans aiguille, sans manipulation de membrane et sans déconnexion de tubulure, avec l’appareil Stéritest® (Millipore). La membrane et le produit à tester ne sont ainsi exposés à aucun moment à l’environnement, ce qui permet de réduire les risques de contamination accidentelle, et par conséquent le nombre de faux positifs.

Les trois antibiotiques utilisés ne couvrent pas les infections à anaérobies, ni les infections fongiques. Un essai de mise au point d’un collyre à l’amphotéricine B congelé a été réalisé, mais s’est heurté au problème du test de stérilité, le collyre obtenu étant une suspension et le service d’hygiène ne possédant pas les équipements nécessaires pour réaliser les analyses adaptées à cette formulation galénique (communication personnelle). Une étude de stabilité d’un collyre renforcé contre les germes anaérobies (métronidazole) est en cours. Le chloramphénicol n’a pas été pas retenu du fait de ses effets indésirables hématologiques dose-dépendants. Nous travaillons aussi sur la possibilité d’associer deux antibiotiques. En effet, les collyres antibiotiques renforcés sont administrés en général toutes les ½ heures à toutes les heures et en théorie à quelques minutes d’intervalle les unes des autres, jour et nuit, ce qui est très contraignant pour le patient et peut réduire sa compliance. Lin et al. [23] ont comparé la stabilité et l’efficacité de la solution d’un mélange d’amikacine et de vancomycine à la solution des deux principes actifs isolés ; les solutions étaient diluées dans de l’eau stérile et réfrigérées à l’abri de la lumière pendant 14 jours. Aucune différence d’activité in vitro (diamètre d’inhibition) n’a été mise en évidence. L’osmolalité du mélange (environ 200 mOsm/L) était supérieure et se rapprochait de la zone de tolérance de l’œil. Le nombre d’applications quotidiennes était réduit d’un tiers. Toutefois, la durée de stabilité du mélange n’a été validée que sur 14 jours. Une étude ultérieure de stabilité d’un mélange congelé pourrait être menée, ce qui permettrait par exemple, de réaliser le mélange d’amikacine et de vancomycine extemporanément. Dans ce travail, nous n’avons pas évalué l’activité antibiotique in vitro. Nous le ferons prochainement pour une étude complémentaire évaluant la pertinence de congélation pendant une durée de 180 jours.

Conclusion

La durée de péremption des collyres à la ceftazidime 5 %, à la vancomycine 5 % et à l’amikacine 5 % est étendue à 75 jours. Après dispensation, ils doivent être utilisés dans les quatre jours et stockés à 4 °C. La fabrication en salle blanche de collyres antibiotiques renforcés limite les contraintes organisationnelles, l’extension de péremption permet des fabrications moins fréquentes de séries plus importantes. Les infirmières et les médecins sont satisfaits puisque la préparation de ces solutions, effectuée auparavant sur paillasse dans le service de soins, est réalisée maintenant à la pharmacie dans des conditions contrôlées. L’évolution du nombre de collyres fabriqués par notre pharmacie est en constante croissance. En 2004, 197 collyres ont été fabriqués, 24 ont été administrés et les autres ont servi à l’étude de validation. En 2005, 444 collyres ont été fabriqués, 245 utilisés ont été administrés, 175 ont servi à une étude d’extension de la péremption et 24 « périmés » ont été jetés. Les collyres sont soit dispensés pour des patients hospitalisés, soit rétrocédés pour des patients ambulatoires. Le coût d’un collyre intègre celui des matières premières, du temps de fabrication et celui des contrôles physiques, chimiques, et microbiologiques effectués sur chaque série fabriquée. Le coût de traitement actuel se situe aux alentours de 15 e le collyre pour 4 jours de traitement. Ce coût peut paraître élevé, mais il est la conséquence d’une préparation réalisée stérilement, suivie de contrôles de fabrication, tout en permettant une mise à disposition immédiate du collyre.

Remerciements : Nous remercions Monsieur le Professeur Le Coutour, chef de service du laboratoire d’hygiène de l’hôpital, pour les tests de stérilité effectués par son personnel.

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