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Gastroentérologie Clinique et Biologique
Vol 29, N° 8-9  - août 2005
Doi : GCB-8-9-2005-29-8-0399-8320-101019-200515132
Hépatites Virales

CA46
MISE AU POINT D'UNE TECHNIQUE PERMETTANT D'OPTIMISER LA DÉTECTION DE LA RÉPLICATION DU VIRUS DE L'HÉPATITE C
 

M Carrière [1], A Breiman [2], V Pène [3], F Conti [1 et 4], S Chouzenoux [1], M Andrieu [5], P Jaffray [6], L Grira [6], O Soubrane [1 et 4], P Sogni [1 et 7], Y Calmus [1 et 4], S Chaussade [1 et 7], AR Rosenberg [3 et 8], P Podevin [1 et 7]
[1] Upress 1833, Faculté de Médecine Paris 5
[2] Groupe Hépacivirus, Institut Pasteur Paris
[3] INSERM, Equipe Avenir, Institut Cochin, Paris
[4] Services de Chirurgie, Hôpital Cochin, Paris 5
[5] INSERM U567, CNRS UMR 8104, Paris 5
[6] Biochimie, Hôpital Cochin, Paris 5
[7] Hépatogastroentérologie, Hôpital Cochin, Paris 5
[8] Virologie, Hôpital St-Vincent de Paul, Paris 5.

Introduction

La détection du brin anti-sens de l'ARN du virus de l'hépatite C (VHC) est habituellement reconnue comme une preuve de réplication du génome viral. Cependant, cette détection se heurte à différents problèmes pratiques. D'une part, la spécificité de l'amplification peut être prise en défaut par mésappariement des amorces. D'autre part, la sensibilité de la quantification peut être prise en défaut par la très faible réplication du VHC in vitro.

But de l'étude

Nous décrivons une nouvelle technique de RT PCR permettant de concilier ces deux impératifs, et en présentons des applications in vivo et in vitro.

Matériels et méthodes

Des ARN sens et anti-sens du VHC ont été synthétisés par transcription in vitro à partir d'un plasmide portant l'ADNc de la région 5'non codante d'un isolat de génotype 1b. La transcription inverse a été faite à 60°C à l'aide de thermoscriptTM (Life technologies) et d'une amorce comportant une séquence d'hybridation spécifique à la région 5'non codante du génome viral ainsi qu'une étiquette. Une première PCR a été réalisée avec un couple d'amorces dont l'une était complémentaire de la séquence servant d'étiquette. La quantification faisait appel à une seconde PCR en temps réel (DNA FastStart SYBR Green Kit, Roche) à l'aide d'amorces nichées. La technique a été validée in vivo à partir d'ARN extraits de biopsies hépatiques de malades ayant une hépatite chronique C. Pour la validation in vitro, des hépatocytes humains isolés par dissociation enzymatique (collagénase) et cultivés sur support collagène ont été mis en présence du sérum d'un malade ayant une hépatite chronique C pendant 12h à 37°C.

Résultats

La sensibilité de l'amplification du brin anti sens, évaluée par dilutions croissantes de l'ARN synthétique, était de 25 copies. En présence de quantités croissantes d'ARN synthétique sens, le signal de détection du brin anti sens conservait sa spécificité jusqu'à 105 copies d'ARN sens ajoutées par réaction. Appliquée à deux biopsies hépatiques, notre technique a permis de quantifier respectivement 3 210 et 2 592 copies/µg d'ARN de brin anti-sens, pour 105 900 et 2 180 000 copies/µg d'ARN de brin sens, soit un ratio brin sens/anti-sens de 32 et 841 respectivement. Trois jours après l'infection d'hépatocytes en culture primaire, notre technique a permis de quantifier 300 copies/µg d'ARN de brin anti-sens, pour 1700 copies/µg d'ARN de brin sens, soit un ratio brin sens/anti-sens de 6.

Conclusion

Très sensible, la présente technique permet avec une bonne spécificité de quantifier in vivo et in vitro la réplication du VHC.





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