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Journal Français d'Ophtalmologie
Volume 32, n° 4
pages 247-256 (avril 2009)
Doi : 10.1016/j.jfo.2009.01.010
Received : 10 August 2008 ;  accepted : 28 January 2009
Effets délétères des dérivés stables du monoxyde d’azote, marqueur inflammatoire des uvéites, sur les différentes tuniques de l’œil de bœuf en culture
Deleterious effects of stable nitric oxide derivatives, a uveitis inflammatory marker, on cultured bovine ocular layers
 

K. Lahmar-Belguendouz a, H. Belguendouz a, D. Hartani b, O.S. Lahlou-Boukoffa c, Z. Djeraba a, A. Lammali a, C. Touil-Boukoffa a,
a Équipe « cytokines et NO Synthases », laboratoire de biologie cellulaire et moléculaire, faculté des sciences biologiques, USTHB Bab Ezzouar, El Alia, BP 32, Alger, Algérie 
b Clinique ophtalmologique, CHU Mustapha, Alger, Algérie 
c Service d’ophtalmologie, CHU Ibn Rochd, Annaba, Algérie 

Auteur correspondant.
Résumé
Introduction

L’uvéite est une inflammation intraoculaire pouvant atteindre les différentes structures de l’œil. Elle est caractérisée par une production importante de monoxyde d’azote, estimée par la mesure de ses dérivés métaboliques stables finaux, les nitrites et les nitrates. L’effet cytotoxique de ces derniers sur la rétine bovine in vitro a été montré dans une étude antérieure. L’objectif de notre étude était d’évaluer leur effet sur la totalité des explants oculaires bovins en culture.

Méthodes

Après examen clinique, des yeux sains bovins ont été obtenus immédiatement après énucléation et ont été transportés au laboratoire à une température de +4°C. Après dissection, des explants oculaires de la partie antérieure et de la partie postérieure de l’œil ont été mis en culture dans du DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal, 2mM de glutamine, 100UI/ml de pénicilline et de 100UI/ml de streptomycine. Les cultures ont été traitées avec différentes concentrations de nitrites et de nitrates (300-500μM). Après un temps d’incubation (24heures-48heures), les explants oculaires ont été fixés dans du formol tamponné à 10 %, et ont fait l’objet d’une étude histologique.

Résultats

Des altérations tissulaires et cellulaires étaient observées dans toutes les structures oculaires, mais à des degrés différents selon la concentration et le temps d’incubation. Les différentes structures oculaires présentaient des sensibilités différentes vis-à-vis de la nature du métabolite et de sa concentration. La sclérotique était la structure ayant montré le plus de résistance alors que l’épithélium cornéen ainsi que celui des procès ciliaires étaient les plus atteints.

Conclusion

Cette étude montre un effet cytotoxique des nitrites et des nitrates sur les structures oculaires in vitro . Cet effet était proportionnel à la concentration et au temps d’incubation utilisés. Les altérations observées au niveau des différentes structures suggèrent l’implication du monoxyde d’azote, à travers ses dérivés, dans les lésions oculaires observées durant les uvéites.

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Summary
Introduction

Uveitis is an intraocular inflammation affecting various eye segments. This disease is characterized by a high level of nitric oxide production. It is estimated via the quantification of its end products: nitrites and nitrates. In a previous study, we showed the cytotoxic effect of these molecules on bovine retina in vitro . In this study, we investigated the effect of these two molecules on cultured ocular explants in vitro .

Methods

After clinical examination, healthy bovine eyes were obtained immediately after enucleation and were transported to the laboratory at +4°C. After dissection, ocular explants from anterior and posterior segments were cultured in DMEM supplemented with 10% of FBS, 2mM glutamine, 100UI penicillin, and 100UI/ml streptomycin. Cultures were treated with either nitrites or nitrates at different concentrations (300-500μM). After culture incubation (24-48h), ocular explants were fixed in buffered formalin and the histological study was performed.

Results

All structures showed structural alterations in relation with culture duration and molecule concentrations. The different structures showed different degrees of sensitivity depending on the type and concentration of the metabolite used. Sclerotic analysis showed very little response to the two molecules, whereas the cornea and ciliary process epithelia showed the highest sensitivity.

Conclusion

Our results showed a cytotoxic effect of nitrites and nitrates on ocular structures in vitro . This effect was correlated with molecule concentration and duration of exposure. The structural alterations observed suggest that nitric oxide, via its products, is implicated in the ocular lesions observed during uveitis.

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Mots clés : Monoxyde d’azote, Uvéite, Nitrites, Nitrates

Keywords : Nitric oxide, Uveitis, Nitrites, Nitrates


Introduction

L’uvéite est une inflammation pouvant atteindre toutes les structures intraoculaires [1]. D’étiologie très diverse, elle peut être d’origine infectieuse, inflammatoire, parasitaire, virale ou médicamenteuse [2, 3]. Elle reste cependant idiopathique dans près de 60 % des cas [1].

L’uvéite peut conduire à la cécité dans 5 % à 20 % des cas en Europe [4] et dans 10 % des cas aux Etats-Unis [5]. Elle peut être une maladie locale telle que l’ophtalmie sympathique ou le signe d’une maladie systémique atteignant différents organes comme la maladie de Behçet et la sarcoïdose. Le facteur auto-immun est un des mécanismes élucidant la survenue d’une uvéite lors de la maladie de Behçet. L’antigène S, protéine localisée essentiellement dans les photorécepteurs, est une des protéines majeures impliquées dans l’initiation des uvéites auto-immunes [6, 7].

Les mécanismes physiopathologiques de l’uvéite impliquent surtout les réponses immunitaires à médiation cellulaire [8, 9]. En effet, une activation importante des leucocytes en général et des monocytes et des lymphocytes en particulier est observée au niveau local impliquant une réponse contre les structures oculaires [10].

L’infiltrat cellulaire, retrouvé au cours des uvéites, est attiré au site de l’inflammation par de nombreux médiateurs dont les principaux sont les cytokines [5]. Certaines cytokines, retrouvées dans les sérums des patients atteints d’uvéite, ont la propriété d’induire la synthèse d’une enzyme, la NO-synthase de type 2, dans divers types cellulaires tels que les macrophages, les neutrophiles, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et l’épithélium pigmentaire rétinien [11, 12, 13, 14]. Dès lors, ces cellules produisent de façon continue et soutenue du monoxyde d’azote (NO). Le NO ainsi produit exercerait des fonctions immunorégulatrices dans les conditions physiologiques ou cytotoxiques selon sa concentration [15, 16].

Le NO est un radical libre qui, dans un milieu aqueux et en présence d’oxygène, réagit rapidement avec ce dernier pour donner des dérivés oxygénés tels que les nitrites et les nitrates. Ces métabolites du NO seraient les effecteurs de son action vue leur réactivité avec le milieu environnant. Le NO peut être produit au niveau oculaire par différentes sources. En effet, de nombreuses études ont montré sa production par les cellules locales ou infiltrant [17, 18].

Différentes études ont montré des taux élevés de nitrites et de nitrates chez les patients atteints d’uvéite au cours de la maladie de Behçet (taux sériques ou taux urinaires) [14, 19]. De même, les travaux de Hartani et al. (2006) ont montré que ces deux métabolites physiologiques du NO ont une action délétère au niveau de la rétine de bœuf en culture. Ces observations appuieraient l’hypothèse de l’implication du NO dans les lésions rétiniennes constatées lors de cette maladie [16]. Ces données nous ont amenés à explorer l’effet de ces deux métabolites du NO, les nitrites et les nitrates, aux taux retrouvés chez les patients atteints d’uvéite Behçet sur les différentes tuniques de l’œil mises en culture.

Matériel et méthodes
Matériel et réactifs

Tous les réactifs utilisés dans cette étude sont des produits de Sigma-Aldrich (Allemagne). Les nitrites et les nitrates étaient fournis sous forme de poudre (pureté supérieure à 99 %).

Culture des tuniques oculaires

Les yeux de bœufs ont été récupérés à partir d’animaux sains après abattage. Ils sont mis à +4°C immédiatement après énucléation. Une incision a été réalisée au niveau équatorial et les deux hémisphères ont été séparés. Le cristallin a été écarté et le vitré enlevé. Des explants ont été prélevés de la partie antérieure et de la partie postérieure, et déposés dans des boîtes de culture (Nunc) contenant du DMEM (Sigma-Aldrich, Allemagne), additionné de SVF (Sigma-Aldrich, Allemagne) à 10 %, de 2mM de glutamine et d’antibiotiques (100UI/ml de pénicilline et 100UI/ml de streptomycine), en présence ou en absence de l’effecteur considéré (nitrites, nitrates) à différentes concentrations.

Les concentrations utilisées pour les traitements avec les nitrites et les nitrates ont varié entre 300μM et 500μM. Les cultures ont été réalisées à 37°C pendant 24 et 48heures, sous une atmosphère humide à 5 % de CO2 .

Techniques histologiques

Après incubation, les explants ont été fixés dans du formol tamponné à 10 % ou dans le fixateur de Verhoeff. Les échantillons ont été déshydratés dans des bains d’éthanol à des degrés croissants, imprégnés au toluène, puis inclus dans de la paraffine. Les colorations utilisées ont été la coloration de Mallory et la coloration à l’hémalun-éosine. Les coupes ont été observées au microscope photonique.

Résultats
Étude histologique de l’action des nitrites sur les explants oculaires bovins in vitro

Les cultures des explants oculaires non traités (témoins) n’ont montré aucune altération avec une organisation générale similaire à celle des tissus sains. En effet, la partie postérieure était composée d’une rétine stratifiée (Figure 1A), d’une choroïde riche en vaisseaux sanguins et en cellules pigmentaires (Figure 2A) et d’une sclérotique épaisse formée d’un tissu conjonctif très dense contenant quelques cellules pigmentaires (Figure 3A).



Figure 1


Figure 1. 

Aspects histologiques de la rétine mise en culture (A) Rétine témoin montrant une structure stratifiée : CG : couche ganglionnaire, CPI : couche plexiforme interne, CNI : couche nucléaire interne, CPE : couche plexiforme externe, CNE : couche nucléaire externe, CPR : couche des photorécepteurs, Mb L : membrane limitante (Vt : vitré) (G ×180, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (B) Rétine mise en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 24heures : la structure de la rétine est altérée (flèches) (G ×90, fixateur formol, coloration Hématoxyline- Eosine). (C) Rétine mise en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 48heures : destruction des différentes couches composant la rétine (G ×22,5, fixateur formol, coloration hématoxyline-éosine). (D) Rétine mise en culture en présence de 300μM de NO3 pendant 48heures : la rétine est complètement déstructurée (G ×90). *: Détail de la région encadrée montrant des altérations reflétées par la présence de noyaux ayant différentes affinités tinctoriales ainsi que la disparition des membranes cellulaires laissant un amas aléatoire (G ×180, fixateur formol, coloration Mallory).

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Figure 2


Figure 2. 

Aspects histologiques de la choroïde mise en culture. (A) Choroïde témoin caractérisée par une richesse en cellules pigmentées, conférant un aspect très dense, et en vaisseaux sanguins (VSg) (G ×180, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (B) Choroïde mise en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 24heures : épaisseur de la choroïde peu augmentée, vasodilatation des vaisseaux sanguins (VSg) (G ×180, fixateur formol, coloration Mallory). (C) Choroïde mise en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 48heures : une vasodilatation importante (VSg) est observée avec détachement des différentes strates sous forme de lanières (flèches) (R : rétine, Sc : sclère) (G ×90, fixateur formol, coloration Mallory). (D) Choroïde mise en culture en présence de 300μM de NO3 pendant 48heures : la structure de la choroïde est complètement altérée et se présente sous forme de lanières (flèches) (G ×90, fixateur formol, coloration Mallory).

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Figure 3


Figure 3. 

Aspects histologiques de la sclérotique mise en culture. (A) Sclérotique témoin formée de fibres collagènes disposées en faisceaux agencés parallèlement entre lesquelles se trouvent les fibroblastes fusiformes reconnaissables par leur noyau (flèches) (G ×40, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (B) Sclérotique mise en culture en présence de 300μM de NO2 pendant 48heures : les vaisseaux sanguins (VSg) sont entourés de quelques cellules activées (flèches) (TC : tissu conjonctif) (G ×90, fixateur formol, coloration hématoxyline-éosine). (C) Sclérotique mise en culture en présence de 500μM de NO2 pendant 48heures : le nombre de cellules activées (flèches) autour d’un vaisseau sanguin (VGs) a augmenté sans altération du tissu conjonctif (G ×90, fixateur formol, coloration hématoxyline- éosine). (D) Sclérotique mise en culture en présence de 500μM de NO2 pendant 48heures : une forte concentration de cellules activées est observée (flèches jaunes) du côté de la choroïde (un aspect en lanières détachées, flèche noire). Les faisceaux de fibres collagènes restent intacts (G ×90, fixateur formol, coloration hématoxyline-éosine). * : Détail de quelques cellules activées (G ×180). (E) Sclérotique mise en culture en présence de 500μM de NO3 pendant 24heures : le tissu conjonctif (Fc) est resté intact avec apparition de cellules activées (flèches) très denses du côté de la choroïde surtout (G ×20, fixateur Verhoeff, coloration Mallory).

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Par ailleurs, au niveau de la partie antérieure, la cornée présentait un épithélium pluristratifié non kératinisé reposant sur une membrane de Bowman, un stroma dense et une membrane de Descemet et un endothélium (Figure 4A). De même, le corps ciliaire, en continuité avec la cornée, était constitué d’un tissu conjonctif dense où se retrouvait une riche vascularisation (Figure 5A). Les procès ciliaires, d’allure homogène et formant des expansions à partir du corps ciliaire, avaient un épithélium continu, bistratifié, l’un pigmentaire et l’autre non pigmentaire, entourant un stroma conjonctif vascularisé (Figure 6A). Relié au corps ciliaire, l’iris présentait un épithélium antérieur reposant sur un stroma conjonctif contenant des fibroblastes et des chromatophores. En dessous de cette couche, se trouvait une couche de vaisseaux sanguins à paroi très épaisse reposant sur des fibres musculaires qui constituent le sphincter (Figure 7A).



Figure 4


Figure 4. 

Aspects histologiques de la cornée mise en culture. (A) Cornée témoin présentant épithélium (Ep) pluristratifié reposant sur la membrane de Bowman (Mb B) et un stroma (S) possédant un aspect homogène avec des couches superposées liées entre elles (G ×20, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (B) Cornée mise en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 24heures : l’épithélium (Ep) est pluristratifié et détaché de la membrane de Bowman (Mb B) avec des cellules superficielles desquamées (flèches). Le stroma (S) a un aspect homogène avec des couches superposées liées entre elles (Gx 90, fixateur formol, coloration Mallory). (C) Cornée mise en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 48heures : l’épithélium (Ep), détaché de la membrane de Bowman (Mb B), est déstructuré avec détachement des cellules entre elles (flèches). Le stroma (S) présente un aspect homogène (G ×45, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). * : Détail de quelques cellules détachées (G ×180). (D) Cornée mise en culture en présence de 300μM de NO3 pendant 24heures : l’épithélium (Ep) montre une desquamation des cellules superficielles (flèches bleues), une altération des cellules basales (flèches noires) avec présence de cellules rondes à noyau dense et d’autres possédant un cytoplasme vacuolisé ainsi qu’un détachement de la lame basale (MbB). La structure du stroma est conservée (S) (G ×90, fixateur formol, coloration Mallory). (E) Cornée mise en culture en présence de 500μM de NO3 pendant 48heures : l’épithélium (Ep) est complètement altéré avec désorganisation totale des cellules (flèches noires) et un début de dissociation des faisceaux de fibres collagène (flèches violettes) (G ×45, fixateur formol, coloration Mallory).

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Figure 5


Figure 5. 

Aspects histologiques du corps ciliaire mis en culture. (A) Corps ciliaire témoin formé par du tissu conjonctif (Tc) abritant des vaisseaux sanguins et donnant des prolongements axiaux pour former les procès ciliaires (PC) (G ×22,5, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (RT : Réseau Trabéculaire). (B) Corps ciliaire mis en culture en présence de 300μM de NO2 pendant 48heures : quelques activées (flèches) sont observées (G ×90, fixateur formol, coloration Mallory).* : Le détail d’une cellule activée est montré à fort grossissement (G ×180). (C) Corps ciliaire mis en culture en présence de 400μM de NO3 pendant 48heures : une vasodilatation (VSg) est visible ainsi qu’une activation cellulaire (flèches) tout autour des vaisseaux sanguins également (G ×90, fixateur formol, coloration Mallory).

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Figure 6


Figure 6. 

Aspects histologiques des procès ciliaires mis en culture. (A) Procès ciliaire témoin. À gauche, en vue générale: villosités en continuité avec le corps ciliaire baignant dans l’humeur aqueuse (Haq) (G ×45, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). À droite, détail d’un procès ciliaire : visualisation des deux couches épithéliales, l’une très colorée pigmentaire (Ep P) et l’autre claire non pigmentaire (Ep Np). Dans l’axe du procès ciliaire, se trouve du tissu conjonctif (TC) vascularisé (VSg) (G ×180, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (B) Procès ciliaire mis en culture en présence de 300μM de NO2 pendant 24heures : l’épithélium non pigmentaire est complètement désagrégé (flèches). La structure de l’épithélium pigmentaire (Ep p) est légèrement altérée, mais les cellules sont conservées (G ×180, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (C) Procès ciliaire mis en culture en présence de 300μM de NO3 pendant 48heures : l’épithélium non pigmentaire (Ep Np) est presque totalement altéré laissant des débris (d), et l’épithélium pigmentaire (Ep p) commence à être lésé (G ×180, fixateur Formol, coloration Mallory). (D) Procès ciliaire mis en culture en présence de 400μM de NO3 pendant 48heures : une altération profonde touche les épithéliums pigmentaire et non pigmentaire (flèches) avec une vasodilatation (VSg) visible dans le stroma (S) (G ×40, fixateur formol, coloration Mallory).

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Figure 7


Figure 7. 

Aspects histologiques de l’iris mis en culture. (A) L’iris témoin est bordé par deux épithéliums, antérieur fin (Ep ant) et postérieur fortement pigmenté (Ep post). Le corps de l’iris est formé par du tissu conjonctif contenant des fibroblastes et des mélanocytes ainsi que des vaisseaux sanguins (VSg) à paroi assez épaisse. Les fibres musculaires lisses (M) forment le sphincter et le muscle dilatateur (G ×90, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (B) Iris mis en culture en présence de 400μM de NO2 pendant 24heures : l’épithélium postérieur (Ep p) est altéré. Le stroma (S) possède un tissu conjonctif assez lâche (flèches noires). Les vaisseaux sanguins (VSg) montrent une vasodilatation (flèches blanches). (G ×90, fixateur formol, coloration Mallory). (C) Iris mis en culture en présence de 500μM de NO2 pendant 48heures : les deux épithéliums de l’iris (flèches) sont altérés et détachés du corps de ce dernier. Le stroma (S) possède une trame très lâche de tissu conjonctif. (Gx 45, fixateur Verhoeff, coloration Mallory). (D) Iris mis en culture en présence de 300μM de NO3 pendant 24heures : l’épithélium postérieur (EpP) est altéré (flèches). Le tissu conjonctif est dense et ne présente pas d’altération (G ×90, fixateur Formol, coloration Mallory). (E) Iris mis en culture en présence de 400μM de NO3 pendant 48heures : l’épithélium postérieur est altéré et la trame conjonctive (TC) est très lâche. Les vaisseaux sanguins (VSg) montent une vasodilatation (PC : procès ciliaire) (G ×45, fixateur formol, coloration Mallory).

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La mise en culture des explants oculaires en présence des nitrites a induit de nombreuses altérations tissulaires et cellulaires. Ces effets délétères touchaient les tuniques de l’œil à des degrés différents selon la concentration utilisée et la durée d’incubation.

Effets des nitrites sur les explants oculaires postérieurs

Des altérations tissulaires engendrées par les nitrites sur les explants préparés commençaient à apparaître au niveau de la rétine dès l’utilisation de la concentration égale à 300μM après 24heures d’incubation. En effet, la rétine présentait un aspect de désorganisation structurale similaire à celle décrite antérieurement par Hartani et al. [16]. Cet effet s’accentuait pour la même concentration au-delà de 24heures d’incubation (Figure 1C).

Des modifications structurales de la choroïde étaient également observées à des concentrations supérieures ou égales à 400μM. Il s’agissait d’importantes vasodilatations accompagnées d’une augmentation de l’épaisseur de la choroïde (Figure 2B). Après 48heures d’incubation, les cellules se détachaient en association avec les fibres collagène formant des lanières. De même, les vaisseaux sanguins subissaient une vasodilatation accrue pouvant aller jusqu’à leur éclatement (Figure 2C).

La sclérotique ne semblait pas être affectée histologiquement par les nitrites quelles que soient la concentration utilisée et/ou la durée d’incubation. Toutefois, une activation des cellules, traduite par une augmentation de leur taille, était observée. Ces cellules activées étaient essentiellement retrouvées du côté de la choroïde et autour des vaisseaux sanguins (Figure 3D).

Effets des nitrites sur les explants oculaires antérieurs

Le côté antérieur était également affecté, avec une sensibilité aux nitrites différente selon le type cellulaire.

L’épithélium cornéen se décollait de la membrane de Bowman, les cellules superficielles se détachant (desquamantes) à partir de la concentration de 400μM et après 24heures d’incubation (Figure 4B). À plus fortes concentrations une désorganisation générale de l’épithélium était observée avec l’apparition de cellules de petites tailles présentant une vacuolisation cytosolique et la libération de cellules de forme sphérique (Figure 4C). Au niveau du stroma cornéen, il était noté une légère dissociation des fibres conjonctives. Cet effet serait dû à un œdème ou à une rétraction des fibres collagènes (Figure 4B).

Les modifications structurales touchaient également les procès ciliaires. En effet, ces derniers perdaient, en premier lieu, leur épithélium non pigmenté par éclatement cellulaire. Ces modifications structurales étaient en relation étroite avec la concentration utilisée. Elles débutaient à 300μM après 24heures d’incubation (Figure 6B), avec la mise en évidence d’une fragmentation des membranes. À l’inverse, l’épithélium pigmentaire n’était sensible à l’action des nitrites qu’à très fortes concentrations. À ce niveau, le tissu conjonctif ne semblait pas être affecté.

L’iris était également touché par le traitement avec les nitrites. Selon les concentrations utilisées, ces derniers induisaient des lésions au niveau de l’épithélium (à 400μM après 24heures d’incubation) (Figure 7B). La trame conjonctive devenait lâche, se dissociant presque totalement à la concentration de 500μM de nitrites et après 48heures d’incubation (Figure 6C).

Aucune altération structurale induite par l’action des nitrites n’est observée sur le corps ciliaire. À l’inverse, il existait une affluence cellulaire sur ce site, se traduisant par une activation et une infiltration de cellules activées (Figure 5B).

Étude histologique de l’action des nitrates sur les explants oculaires bovins in vitro

Le traitement in vitro des explants oculaires avec les nitrates a montré des effets similaires à ceux engendrés par nitrites. Les nitrates avaient toutefois un effet vasodilatateur plus important que celui des nitrites, en particulier au niveau de l’iris et des procès ciliaires.

Effets des nitrates sur les explants oculaires postérieurs

Des altérations tissulaires au niveau des explants postérieurs étaient observées au niveau de la rétine dès l’utilisation de concentrations égales à 300μM de nitrates, après 24heures d’incubation. La rétine présentait un aspect de désorganisation structurale similaire à celui observé avec les nitrites, cet effet augmentant avec la concentration utilisée et la durée d’incubation. Un effet maximal était observé au bout de 48heures d’incubation (Figure 1D).

Une altération totale de la choroïde était notée en présence de nitrates à la concentration de 300μM pendant 48heures, allant jusqu’à sa disparition totale. À l’échelle macroscopique, cette dernière se fragmentait et se détachait de la sclérotique. Cet état a été rattaché à une importante vasodilatation conduisant à l’éclatement de cette couche (Figure 2D).

La sclérotique ne semblait pas être affectée histologiquement par l’action des nitrates quelles que soient la concentration utilisée et/ou la durée d’incubation. Cependant, une activation cellulaire inférieure à celle observée sous l’effet des nitrites était notée (Figure 3E).

Effets des nitrates sur les explants oculaires antérieurs

À partir d’une concentration de 300μM de nitrates et après 24heures d’incubation, un détachement de l’épithélium cornéen de la membrane de Bowman était observé. Il conservait un aspect pluristratifié, mais les cellules superficielles étaient aplaties. Ces dernières se décollaient ensuite de l’ensemble de la couche. Certaines cellules de la couche basale de l’épithélium cornéen avaient des noyaux de petite taille et une vacuolisation cytoplasmique prononcée. À plus fortes concentrations, l’épithélium était hautement altéré, les cellules superficielles se détachaient et avaient une forme arrondie alors que les cellules de la couche basale gardaient leur forme allongée (Figure 4D). A la concentration de 500μM de nitrates, les cellules épithéliales étaient individualisés, toutes détachées les unes des autres, avec des noyaux très denses. Des altérations structurales du stroma, se traduisant par une dissociation des fibres de collagène visualisée par des espaces entre les fibres, étaient constatées à 500μM de nitrates et à 24heures d’incubation (Figure 4E).

Une vasodilatation importante associée à une faible activation cellulaire était notée au niveau du corps ciliaire à partir de 400μM de nitrates, après une incubation de 24heures (Figure 5C). Des altérations concentration- et durée-dépendantes étaient également observées au niveau des procès ciliaires. Le phénomène de vasodilatation était constaté même dans les petits vaisseaux. L’épithélium non pigmenté était altéré par éclatement cellulaire à partir de la concentration de 300μM après 24heures d’incubation (Figure 6C). À 400μM et après 48heures d’incubation, un détachement de l’épithélium pigmentaire du stroma conjonctif était constaté (Figure 6D).

L’iris présentait des lésions au niveau épithélial à partir de 300μM de nitrates après 24heures d’incubation (Figure 7D). Ces effets délétères étaient observés au niveau de la trame conjonctive qui devenait très lâche à partir de 400μM de nitrates et après une incubation de 48heures (Figure 7E).

Discussion

Cette étude montre les effets délétères induits par les dérivés du NO selon leur nature, leur concentration et la durée d’incubation sur les différentes tuniques de l’œil de bœuf en culture. Les premiers effets concernaient la rétine, l’épithélium cornéen et les vaisseaux sanguins. Les autres structures étaient atteintes lors de l’utilisation de fortes concentrations et/ou de durée d’incubation prolongée. Seule la sclérotique est restée peu sensible à l’action des dérivés du NO.

Conformément aux résultats précédemment obtenus, nous avons observé des altérations tissulaires et une toxicité cellulaire occasionnée par l’effet des nitrites et nitrates d’une manière dose- et temps-dépendantes [16]. La toxicité exercée par le NO est généralement due à son action sur les enzymes cellulaires, notamment celles du cycle de Krebs et de la chaîne respiratoire, sur l’ADN et sur les lipides [20, 21, 22]. En effet, le NO peut, directement ou à travers ses dérivés : (i) inhiber les enzymes de la chaîne respiratoire, notamment la cytochrome-C-oxydase, induisant ainsi un épuisement de l’ATP, (ii) inhiber la glycolyse au niveau de la glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase, et (iii) activer la poly-ADP-ribose-polymérase (PARP) et la poly-ADP-ribose-synthétase (PARS) [23].

Il est à noter la relation étroite existant ente le NO radicalaire et le système nitrite/nitrate dans l’instauration et les actions physiopathologiques, en particulier dans les dommages tissulaires et cellulaires associés aux processus inflammatoires. De nombreux travaux ont en effet montré la présence active de systèmes de réduction dans les cellules de mammifères. En effet, certains travaux ont montré que la xanthine oxydase pouvait réduire les nitrates et les nitrites en NO radicalaire dans certaines conditions. De même, il existe une « nitrite-réductase » qui réduirait les nitrites en NO [24]. Ces mécanismes seraient probablement à l’origine des effets que nous avons observés.

Dans notre étude, la cornée a montré une sensibilité différentielle aux dérivés du NO selon le type de tissu concerné. L’épithélium était le plus touché par les dérivés du NO (nitrites et nitrates). Cet effet délétère débutant initialement par une desquamation était suivi d’un état d’ulcération marquée, allant jusqu’à la destruction totale du tissu épithélial par endroits. Ces observations sont en faveur de l’hypothèse d’une action apoptotique probable induite par les deux effecteurs utilisés. Cet argument est justifié par l’apparition de cellules vacuolisées et arrondies traduisant un état de souffrance allant jusqu’à la mort cellulaire. De même, le NO pourrait induire des lésions tissulaires s’exprimant par l’altération structurale des protéines du cytosquelette impliquées dans les jonctions cellulaires de type tight (l’actine F et la ZO-1) [25]. Des changements morphologiques du stroma de la cornée n’ont été observés qu’à des concentrations élevées de nitrites et de nitrates. En effet, les fibres collagènes semblent être sensibles à l’action du NO. Cette sensibilité au NO s’exprimerait par une diminution de la production des protéines de la matrice extracellulaire, telles que le collagène de type I, dans les fibroblastes. Dans ce cas, le NO agirait par une inhibition directe de la synthèse du collagène via une hydroxylation de la proline. Toutefois, cet effet diffère selon la structure étudiée. En effet, la cornée était plus affectée que la sclérotique. Ces différences seraient dues aux différents types de collagènes constituant la matrice extracellulaire ou bien à ses autres composants. Ainsi, le stroma et la sclérotique sont formés de quatre types de collagène : I, III, V, et VI. La cornée contient des glycosamino-glycanes (GAG ou muco-polysaccharides) reliés aux fibres de collagènes ou aux protéines solubles, qui agissent comme des anions pour se lier aux cations et à l’eau. Les trois fractions majeures des GAG sont le kératane sulfate, la chondroïtine, et la chondroïtine sulfate A. Ces molécules existent peu ou pas au niveau de la sclérotique. Ces différences de structures de collagène seraient en relation avec l’absence d’effet perçue après l’action des dérivés du NO sur les cultures de sclérotique [26, 27, 28]. Toutefois, nous avons porté une attention particulière à l’activation cellulaire observée, notamment dans les régions adjacentes à la choroïde. Cette activation porte essentiellement sur les cellules phagocytaires (macrophage, cellules dendritiques) présentes localement et agissant probablement localement en réponse aux débris des cellules et à d’autres molécules résultant de l’action cytotoxique du NO [29, 30].

Au niveau des structures composant l’uvée, nous avons observé à la fois une importante vasodilatation et une destruction des différents épithéliums ainsi qu’un relâchement du tissu conjonctif et une activation cellulaire au niveau de l’iris et du corps ciliaire. Ces résultats reflètent une différence dans la sensibilité à l’action du NO par les structures de l’uvée. En effet, selon le type cellulaire et la présence de molécules à activité anti-oxydante dans le microenvironnement, le NO peut exercer une action cytotoxique ou activatrice/anti-apoptotique [31].

De manière globale, un phénomène de vasodilatation était noté au niveau des vaisseaux sanguins de toutes les structures oculaires, occasionné par les nitrites et les nitrates, les deux métabolites physiologiquement stables de NO. Le NO est connu pour son action vasodilatatrice [22]. En effet, il peut induire la relaxation des muscles lisses par deux mécanismes : (i) l’activation de la guanylate-cyclase en se liant à son groupement hème. Il en résulte une augmentation de taux de GMPc, induisant une relaxation du muscle principalement par diminution du Ca2+ intracellulaire ; (ii) l’activation des canaux K+/Ca2+-dépendants.

Les résultats de notre étude corroborent les résultats obtenus in vivo sur des modèles expérimentaux (rat et lapin). En effet, le phénomène de vasodilatation locale due au NO a été démontré au niveau du corps ciliaire, de l’iris, de la choroïde et de la rétine [32, 33, 34, 35, 36, 37, 38].

Conclusion

Les dérivés du monoxyde d’azote seraient impliqués dans les lésions cliniques des uvéites. Ainsi, le NO, tout comme ses dérivés, serait modérément synthétisé dans les conditions physiologiques alors que, durant des processus tels que l’inflammation où le NO est libéré en excès, son action deviendrait délétère sur les tissus environnants.

Notre étude montre que le NO par ses formes physiologiques, nitrites et nitrates, agit de manière délétère sur les différentes tuniques de l’œil. Cet effet délétère est retrouvé lors de l’uvéite chez l’homme. Il est donc fort probable que le NO soit largement impliqué dans la toxicité tissulaire et cellulaire de l’œil par sa production locale et sa diffusion à travers les membranes dans les inflammations intraoculaires associées aux uvéites.


Remerciements

Cette étude a été réalisée dans le cadre de deux programmes de recherche algériens : projet MERS et projet ANDRS (Agence Nationale pour le Développement de la Recherche en Santé, code : 03/06/00/07/019).

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