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Journal de Gynécologie Obstétrique et Biologie de la Reproduction
Volume 40, n° 3
pages 211-215 (mai 2011)
Doi : 10.1016/j.jgyn.2010.12.008
Received : 15 July 2010 ;  accepted : 23 December 2010
Effet immobilisant des spermatozoïdes par les extraits des feuilles du Cestrum parqui
Sperm immobilizing effect of leaves extracts of Cestrum parqui
 

S. Jellad a, , S. Kamoun a, M. Mehdi a, S. Zakri b, M. Trabelsi a, A. Saad a, M. Ajina a
a Laboratoire de cytogénétique et de biologie de reproduction, CHU Farhat-Hachad, Sousse, Tunisie 
b Laboratoire d’histologie et d’embryologie, faculté de médecine, Tunis, Tunisie 

Auteur correspondant.
Résumé
But

L’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel spermicide des extraits de feuilles Cestrum parqui en étudiant ses effets sur la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes in vitro.

Matériels et méthodes

Les spermes ont été préparés par centrifugation sur un gradient de densité PureSperm® (90 et 45 %) puis incubés avec des concentrations variables des saponines extraites du Cestrum parqui (40–250μg/mL) à 37°C et sous 5 % de CO2 . L’activité spermicide a été évaluée en étudiant la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes à différents intervalles de temps allant de cinq à 240minutes. Les modifications morphologiques des spermatozoïdes exposés aux saponines ont été évaluées à l’aide d’un microscope électronique à transmission.

Résultats

Un effet dose- et temps-dépendant de cet extrait sur la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes est observé. La concentration moyenne effective des extraits qui induit une immobilisation irréversible des spermatozoïdes est de 250μg/mL. La microscopie électronique a révélé une altération des membranes cytoplasmiques nucléaires et acrosomales.

Conclusion

Notre étude montre que cet extrait naturel possède une activité spermicide in vitro et peut donc remplacer le nonoxynol-9 dans les contraceptifs par voie vaginale.

The full text of this article is available in PDF format.
Summary
Objective

The leaves extracts of Cestrum parqui were reported to have spermicidal activity. The current investigation identified the spermicidal component of the extracts and evaluated its spermicidal potential in vitro, particularly the effects on sperm motility and vitality.

Methods

Sperms were prepared by discontinuous buoyant density gradient centrifugation and incubated with varying concentrations of extract from C. parqui (40–250μg/ml) at 37°C and 5% CO2 . The mode of spermicidal action was evaluated by sperm motility and vitality at different intervals ranging from 5 to 240minutes. Morphological changes in human spermatozoa after exposure to the extract were evaluated under transmission electron microscope.

Results

A dose- and time-dependent effect of this extract on sperm motility and viability was observed. The mean effective concentration of extracts that induced irreversible immobilization was 250μg/ml. Transmission electron microscope revealed a significant damage to sperm membrane in head and acrosomal membranes, notable swelling and disruption.

Conclusion

Our study indicates that this natural extract has potential spermicidal effect in vitro. It can adequately replace nonoxynol-9 in vaginal contraceptives to make them more vaginally safe and ecofriendly.

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Mots clés : Activité spermicide, Cestrum parqui , Mobilité spermatique, Contraceptive

Keywords : Spermicidal, Cestrum parqui , Sperm mobility, Contraceptive


Introduction

Les spermicides, largement employés à des doses élevées peuvent provoquer des ulcérations génitales pouvant accroître le risque de transmission des maladies sexuellement transmissibles. Cependant, il s’avère utile de tester de nouvelles molécules plurivalentes, spermicides et antibactériennes à partir des produits naturels tels que les saponines qui retiennent l’attention aussi bien pour leurs exploitations industrielles que pour leur propriétés pharmacologiques. C’est un vaste groupe d’hétérosides composés d’une chaîne glucidique hydrosoluble et d’une structure triterpénique ou stéroïdique liposoluble, très fréquent chez les végétaux, quelques animaux marins et certaines bactéries[1].

Plusieurs effets biologiques ont été attribués aux saponines tels que l’activité cytotoxique [2, 3] et anticancéreuse [4], l’activité antifongique, molluscucide et insecticide [5]. Les saponines sont aussi recommandées dans le traitement des hypercholestérolémies [6]. Les saponosides de quelques plantes sont utilisés dans la formulation contraceptive, comme des agents ayant une activité sur les cellules spermatiques ou comme substances spermicides [7, 8, 9].

Matériels et méthodes

Les saponines sont extraites à partir des feuilles du Cestrum parqui prélevées à partir du jardin de l’Institut national agronomique de Tunisie, séchées dans une étuve à 40°C pendant trois à quatre jours. Les feuilles sont ensuite finement broyées jusqu’à obtenir une poudre. Cent grammes de cette poudre sont delipidés par l’éther de pétrole et soumis à trois extractions au méthanol (3×300). Le mélange est évaporé dans un évaporateur rotatif à 40°C et le résidu concentré est laissé à l’air libre pour séchage. Un gamme de ce résidu est dissout dans 100mL de méthanol et additionné d’un volume équivalent d’éther éthylique pour provoquer une précipitation. Le précipité obtenu par filtration est ensuite mis en séchage à l’air ambiant et le produit final obtenu est un solide jaune-vert qui brunit avec le temps : saponines brutes (SB).

Cinquante spermes ont été recueillis au laboratoire par masturbation, après liquéfaction à 37°C pendant 30minutes, les différentes paramètres spermatiques ont été analysés. Un autre groupe de 50 spermes avec des bonnes caractéristiques spermatiques obéissant aux normes de l’OMS (au moins 20 millions de numération avec une mobilité progressive d’au moins 50 % de spermatozoïdes 60minutes après l’éjaculation) est considéré comme un groupe témoin.

Les spermes ont été ensuite traités selon la technique de séparation par un gradient de densité PureSperm® 90 et 45 % (Nicadon, JCD, Lyon, France) et le culot final est suspendu dans 300μL de Ferticult (Fertipro JCD) et utilisé pour les divers tests.

Les extraits bruts à différentes concentrations (40, 62,5, 100, 150, 250μg/mL) ont été ajoutés à des spermatozoïdes préalablement traités. L’effet spermicide a été évalué par le Sonder-Cramer test [10]. Cent microlitres de sperme traité sont examinés à des intervalles de temps allant de cinq à 240minutes afin d’estimer la mobilité par microscopie optique et déterminer la concentration effective EC100 : la concentration minimale du spermicide capable de tuer 100 % des spermatozoïdes après 30minutes d’exposition.

L’appréciation de la vitalité a été faite par le test à l’éosine-nigrosine (test de Williams) qui consiste à mélanger 20μL de sperme traité avec un volume égal d’éosine à 1 % et un double volume de nigrosine puis déterminer le pourcentage de spermatozoïdes viables et non viables (têtes colorées) en comptant au moins 100 spermatozoïdes par patient.

Une fraction du sperme est centrifugée puis fixée par une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate 0,2M à pH 7,4 pendant deux heures à plus de 4°C, ensuite lavée trois fois dans la solution tampon. La post-fixation est réalisée à l’acide osmique à 4 % pendant 45 minutes. La déshydratation s’effectue par des passages successifs dans des bains d’alcool, la polymérisation est réalisée d’abord à 45°C pendant 48 heures poursuivie de 24heures à 60°C. Les coupes ultrafines (90nm) réalisées à l’aide d’un microtome Reichert Ultracute sont contrastées en combinant l’acétate d’uranyle et le citrate de plomb. L’observation des coupes est faite avec une microscopie à transmission.

Les données ont été saisies et analysées à l’aide d’un logiciel SPSS (10.0). Le test d’appariement t a été utilisé pour la comparaison des moyennes sur des séries appariées avec un seuil de signification fixé à 5 %.

Résultats
Analyse de la mobilité

La mobilité a été mesurée après l’action des extraits de C. parqui . Un effet spermicide total et instantané a été observé pour des concentrations dépassant les 250μg/mL. À 250μg/mL, 90 % perdent leurs mouvements après cinq minutes et deviennent entièrement immobile au bout de dix minutes. Pour 200μg/mL, la majorité des spermatozoïdes acquièrent des mouvements lents puis s’immobilisent au bout de 30min alors que pour 125μg/mL, les spermatozoïdes mobiles fléchants s’immobilisent en 60minutes. À des faibles doses, l’effet spermicide se manifeste plus lentement, les spermatozoïdes s’immobilisent après 120minutes pour une dose de 100μg/mL et au bout de 240minutes à 62μg/mL (Tableau 1).

La vitalité spermatique

Comparées aux témoins, les courbes de mortalité (Tableau 2) montrent une augmentation régulière de la mortalité des spermatozoïdes suite à l’action des faibles concentrations de saponines, respectivement 40, 62,5 et 100μg/mL. Pour 40μg/mL, la mortalité est de 20 % après dix minutes (10 % pour les témoins) puis augmente pour atteindre 80 % après quatre heures d’essai ; pour des concentrations supérieures (62,5 et 100μg/L), on constate une augmentation constante de la mortalité qui devient totale après quatre heures d’essai. La mortalité totale des spermatozoïdes est atteinte en 30minutes pour des concentrations de 125 et 200μg/mL et seulement en dix minutes en utilisant 250μg de saponines.

Étude ultrastructurale

Le spermatozoïde humain présente à la microscopie électronique une tête ovalaire avec une chromatine dense, l’acrosome couvre les deux tiers antérieurs et le tiers postérieur du noyau. Il est limité par une membrane et reste à une certaine distance de la membrane plasmique et de la membrane nucléaire. La pièce intermédiaire est rétrécie et courte, on reconnaît les colonnes segmentées, le centriole proximal et l’anneau mitochondrial entourant le complexe axonémal. Comparés aux témoins, les spermatozoïdes traités avec les saponines montrent des modifications touchant principalement la tête. Ainsi la membrane plasmique recouvrant la tête est largement dilatée et complètement séparée du noyau qui paraît vacuolé avec une chromatine moins dense.

Ces altérations morphologiques sont amplifiées chez les spermatozoïdes traités avec 200μg/L de saponines. La membrane plasmique est fortement endommagée avec des boursouflures sous forme de vésicules membranaires, voire même interrompue par endroit avec une vacuolisation nucléaire plus intense (Figure 1).



Figure 1


Figure 1. 

Aspect des spermatozoïdes traités avec 200μg/ml des extraits en microscopie électronique à transmission.

Transmission electron microscope of spermatozoa treated with 200μg/ml of extract.

Zoom

Discussion

Les saponines extraites du C. parqui possèdent plusieurs activités biologiques prouvées chez plusieurs mammifères. On leur attribue à la fois l’activité hypocholestérolémiante, insecticide, molluscucide, cytotoxique, anticancéreuse, voire antivirale [4]. Ces activités découlent de l’interaction des saponines avec le cholestérol membranaire et la formation de complexes insolubles saponine–cholestérol engendrant un phénomène de formation de pores et de perte de l’intégrité cellulaire.

Ce travail rapporte l’effet spermicide des extraits des feuilles de C. parqui contre les spermatozoïdes humains. Cette activité dépend à la fois de la concentration et du temps d’exposition de l’extrait avec les spermatozoïdes. Ainsi, une concentration supérieure à 250μg/mL semble avoir un effet instantané (en dix minutes) sur la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes, cela nous permet de définir une fourchette d’activité étroite dose-active/intervalle de temps.

La capacité fécondante du sperme dépend d’autres paramètres en plus de la mobilité, comme la vitalité et la décondensation de la chromatine nucléaire, qui sont de plus en plus appréciés pour prédire le succès de différentes techniques de l’assistance médicale à la procréation (AMP) [11]. Les saponines brutes semblent avoir un effet spermicide efficace en utilisant des doses beaucoup plus faibles qu’avec d’autres agents spermicides connus [8].

La majorité des spermicides extraits des plantes induisent une détérioration de l’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmatique spermatique [12].

Le principe actif utilisé par les spermicides vaginaux est la rupture de lipides dans la membrane du sperme, particulièrement sur l’acrosome, causant la perte de la mobilité et l’inactivation des enzymes qui jouent un rôle dans la fertilisation, comme l’acrosine et l’hyaluronidase, entraînant un dégât de l’architecture membranaire avec une réduction significative de la vitalité [13, 14].

Dans ce travail, l’étude de la mortalité des spermatozoïdes traités par diverses concentrations de saponines nous a montré parfois que le nombre des spermatozoïdes morts est relativement supérieur à celui des immobiles et qu’il existe même des spermatozoïdes roses gardant un mouvement d’oscillation sur place, ce qui nous a permis d’admettre que les saponines endommagent l’intégrité fonctionnelle de la membrane cellulaire du sperme sans causer aucun dégât à son organisation structurelle. Des tels spermicides vont probablement affecter le système de transport membranaire aboutissant à une perturbation de l’équilibre osmotique, ce qui accélère l’entrée du colorant (éosine) dans les spermatozoïdes avant de perdre ultérieurement leur mobilité.

L’altération de l’intégrité membranaire a été confirmée par l’étude ultrastructurale, notamment une atteinte évidente de la tête supposant une interaction possible des saponines avec les lipides de la membrane plasmatique.

Il a été démontré que l’action des saponines sur la membrane des spermatozoïdes découle de la facilité de ces dernières à interagir avec le cholestérol membranaire faisant des complexes saponines–cholestérol [15, 16]. Il s’agit d’une réaction chimique entre la génine saponique et les sites lynphophiles du cholestérol [15, 16, 17]. L’effet spermicide est dû à la modification de l’un des paramètres clés à la fertilisation, la formation de ce complexe perturbe la perméabilité membranaire entraînant soit la sélectivité du transport membranaire, soit la perte de l’activité biologique de la cellule spermatique [15, 18, 19].

Plusieurs études ultrastructurales des spermatozoïdes ont montré que l’altération peut toucher la tête, la pièce intermédiaire et le flagelle [8, 12, 14, 20, 21, 22]. Dans notre étude nous avons noté des modifications au niveau de la tête sans observer des altérations touchant la pièce intermédiaire ou le flagelle. Ainsi, l’effet spermicide peut probablement s’expliquer par le dommage de la tête dû à l’interaction de la membrane avec les saponines. En effet, l’exposition des spermatozoïdes aux conditions hypo-osmotiques entraîne une augmentation du volume de la cellule spermatique consécutive à une entrée d’eau, la membrane s’éclate alors et le spermatozoïde perd son pouvoir fécondant [18, 19]. Nos observations nous autorisent de rapprocher nos résultats avec ceux de la littérature puisque nous relevons la présence d’un gonflement de la membrane plasmique et de la membrane de l’acrosome entraînant sa vésiculisation (boursouflures membranaires et de l’acrosome).

Conclusion

Les résultats de ce travail montrent que cet extrait naturel avec double composante glucidique hydrosoluble et stéroïdique liposoluble est un puissant agent spermicide agissant probablement par une détérioration de l’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique spermatique due à son interaction avec les lipides membranaires entraînant sa perméabilisation exagérée. Les saponines sont des produits naturels susceptibles d’être plus actifs et moins toxiques que les spermicides de synthèse classiques puisque ces derniers présentent une structure différente et sont formés à partir des substances actives bactéricides telles que le chlorure de benzalkonium, le nonoxynol-9, l’actoxynol. En conséquence, cet extrait peut donc remplacer le nonoxynol-9 dans les contraceptifs par voie vaginale [9].

Conflit d’intérêt

Aucun.

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