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Journal Français d'Ophtalmologie
Volume 36, n° 5
pages 408-413 (mai 2013)
Doi : 10.1016/j.jfo.2012.03.019
Received : 21 September 2011 ;  accepted : 22 Mars 2012
Développement galénique et analytique d’un collyre à base de tacrolimus 0,06 %
Galenic and analytic development of tacrolimus 0.06% eye drops
 

A.-S. Gauthier a, , B. Rival c, J. Sahler a, C. Fagnoni-Legat c, S. Limat c, Y. Guillaume b, c, B. Delbosc a, b
a Service d’ophtalmologie, CHU Jean-Minjoz, 2, boulevard Fleming, 25030 Besançon, France 
b Faculté de médecine et de pharmacie, 20, rue Ambroise-Paré, 25000 Besançon, France 
c Pôle pharmaceutique, CHU Jean-Minjoz, 2, boulevard Fleming, 25030 Besançon, France 

Auteur correspondant.
Résumé
Objectifs

L’administration de tacrolimus (FK506) topique, collyre ou pommade, est efficace dans le traitement de certaines pathologies immunologiques de la cornée et dans la prévention du rejet de greffes de cornée à haut risque. Le but de cette étude est la mise au point de la formulation optimale d’un collyre au tacrolimus 0,06 %. Nous proposons un mode opératoire en permettant la préparation.

Méthode

Les matières premières utilisées dans cette nouvelle formulation sont de la poudre de tacrolimus monohydrate et de l’huile de ricin vierge. La procédure de fabrication garantit la continuité de la stérilité du produit. La validation analytique du dosage par chromatographie liquide haute performance permet un contrôle précis de la concentration en tacrolimus.

Résultats

La fabrication et le conditionnement du collyre au tacrolimus à 0,06 % sont encadrés par de nombreux contrôles permettant de garantir notamment sa stérilité et la stabilité de sa composition. Ces collyres, quelle que soit leur mode de conservation, sont stables et stériles 28jours après ouverture et peuvent être conservés trois mois après leur fabrication. Une étude de tolérance du produit est en cours de réalisation.

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Summary
Purpose

The administration of topical tacrolimus (FK506) eye drops or ointment is effective in treating certain immunologic corneal diseases and in the prevention of rejection of high-risk corneal grafts. The purpose of this study is to determine the optimal formulation of tacrolimus 0.06% eye drops. A procedure for preparation is presented and discussed.

Methods

Tacrolimus monohydrate powder and virgin castor oil are used in this new formulation. The manufacturing process guarantees consistency of product sterility. Measurement by high-performance liquid chromatography allows precise control of the concentration of tacrolimus.

Results

The manufacture and packaging of tacrolimus 0.06% eye drops involve numerous controls allowing for guaranteed sterility and stability. The drops remained sterile and stabile for 28 days after opening regardless of storage conditions and can be stored for 3 months after manufacture. Tolerability studies are currently being performed.

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Mots clés : Tacrolimus, Collyre, Huile de ricin, Stabilité de la préparation

Keywords : Tacrolimus, Eye drop, Castor oil, Stability


Introduction

En pathologie oculaire, s’il existe de nombreuses situations en justifiant l’emploi, les collyres immunosuppresseurs à ce jour disponibles sont peu nombreux. La réponse thérapeutique la plus fréquemment proposée repose sur la prescription de corticothérapie locale et générale dont les effets secondaires sont nombreux et peuvent, par conséquent, limiter leurs utilisations (élévation de la pression intra-oculaire, cataracte sous-capsulaire postérieure, risque infectieux accru, retard à la cicatrisation). Par voie générale, au long cours, il existe également des effets secondaires (toxicité gastro-intestinale, désordres hydro-électrolytiques, troubles endocriniens, ostéoporose, risque infectieux).

Les collyres immunosuppresseurs plus spécifiques comme la ciclosporine et le tacrolimus, inhibiteurs de la calcineurine, ont été recommandés dans certaines pathologies oculaires. En effet, ils présentent des effets secondaires moindres par rapport aux corticoïdes, une épargne cortisonique et permettent un résultat clinique significatif. Le tacrolimus inhibe la formation des lymphocytes cytotoxiques, l’activation des lymphocytes T et la prolifération T dépendante des lymphocytes B, la production de lymphokines (interleukines-2 et 3, interféron gamma) et enfin l’expression du récepteur de l’interleukine-2.

L’intérêt de l’utilisation du tacrolimus topique ou systémique a été démontré dans différentes études dans la prévention du rejet de greffe chez l’animal [1, 2, 3] ainsi que chez l’homme [4]. Une efficacité supérieure du collyre au tacrolimus par rapport aux corticoïdes topiques [5] et au collyre à la ciclosporine à 1 % [6] dans la prévention du rejet de greffe de cornée a été mise en évidence. La pommade au tacrolimus 0,03 % (Protopic®) a également été testée comme traitement de seconde ligne, après échec ou intolérance aux corticoïdes locaux et/ou à la ciclosporine, chez des patients à risque élevé de rejet de greffe de cornée [6, 7], ainsi que sur un groupe de patients atteints de pathologies cornéennes liées à un désordre immunologique (blépharoconjonctivite atopique, ulcère de Mooren, pemphigoïde oculaire…) [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], GVH oculaire [18]. Une formulation pommade à 0,01 % a également été testée avec succès [21, 22].

Si dans toutes ces études l’efficacité du tacrolimus est démontrée, il existe des problèmes d’observance liés à une tolérance médiocre. Les patients se plaignent d’effets indésirables gênants tels que rougeurs, brûlures ou larmoiements. Le but de notre étude est, par conséquent, la mise au point d’un collyre à base de tacrolimus 0,06 % selon une formulation nouvelle dont la tolérance serait accrue, et qui permettrait d’offrir une alternative thérapeutique aux patients intolérants aux traitements immunosuppresseurs actuellement proposés.

Matériel et méthodes
Formulation de la préparation

La formule unitaire du collyre au tacrolimus 0,06 % est la suivante :

tacrolimus monohydrate : 0,006g ;
huile de ricin vierge : qsp 10mL.

Les matières premières utilisées sont de la poudre de tacrolimus monohydrate (Inresa®, Bartenheim, France) et de l’huile de ricin vierge (Cooper®, Melun, France).

Matériel de fabrication

Le matériel nécessaire inclut un système stérile de filtration sous vide Stericup® en polystyrène comportant un filtre Millipore Express en polyéthersulfone ayant des pores de 0,22μm de diamètre (Millipore®, Molsheim, France) et d’une seringue Monoject® de 50mL (Tyco Healthcare UK LTD, Irlande).

Procédure de fabrication

La poudre de tacrolimus est pesée et le volume d’huile de ricin mesuré dans une éprouvette en verre. Le tacrolimus est trituré pendant dix minutes avec l’huile de ricin dans un mortier. Ce mélange est transféré dans un batteur mélangeur (N50®, Hobart, Paris, France). La solution est mélangée pendant trois heures afin d’assurer une dissolution optimale et une homogénéisation complète du tacrolimus. La solution finale est filtrée au moyen d’un système de filtration sous vide. L’intégrité du filtre est vérifiée régulièrement par un examen visuel. Une fois la filtration stérilisante terminée, l’unité de filtration et le matériel nécessaire au conditionnement des collyres sont stérilisés dans le sas d’un isolateur stérile. Dans ce dernier, les flacons collyres sont remplis à 10mL à l’aide d’une seringue puis bouchés à l’aide d’un embout compte-goutte et d’un bouchon. Les flacons sont sortis de l’isolateur puis étiquetés.

Conditionnement

Le collyre au tacrolimus est conditionné en flacon en polyéthylène basse densité de 10mL muni d’un embout à couper en polyéthylène et accompagné d’un bouchon constitué du même polymère (Gravis®, Trelaze, France). Les flacons, embouts et bouchons ont été préalablement stérilisés par oxyde d’éthylène. Un sachet Minigrip® constitue le conditionnement secondaire.

Contrôles de la préparation
Contrôle de la fabrication

Les matières premières lors de leurs réceptions subissent conformément aux Bonnes pratiques de préparation un contrôle pour s’assurer de leurs conformités aux exigences de la pharmacopée française. La préparation, avant d’être libérée, subit également plusieurs contrôles de qualité.

Contrôles microbiologiques

Ils sont réalisés avant la libération de la préparation afin d’en garantir sa stérilité. Les milieux de culture utilisés sont du trypticase soja et de la thioglycolate avec résazurine (Biomérieux®, Craponne, France) placés à température ambiante et à 37°C pendant 15 jours.

Contrôles analytiques
Réactifs et solvants

Le méthanol, l’acétonitrile (VWR, Pessac, France), le chloroforme (Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et l’eau ultra pure sont les solvants utilisés pour le développement de la technique de chromatographie liquide haute performance (CLHP).

Matériel chromatographique

En plus des contrôles précédents et dans un souci d’assurer la qualité de la préparation réalisée, un contrôle de la teneur en principe actif des collyres réalisés par CLHP est effectué à l’aide d’un chromatographe Agilent Technologies 1200 Series (Agilent Technologies, Massy, France) et d’une colonne thermostatée Agilent Eclipse XDB-C18 (250mm, 5μm). Les injections sont réalisées via un injecteur automatique. Le débit de la pompe est programmable. Le chromatogramme est analysé à l’aide du logiciel ChemStation for LC 3D systems. La détection du tacrolimus dans le collyre est réalisée en UV à 210nm.

Préparation des échantillons

La formulation du collyre fabriqué est vérifiée pour garantir une concentration de 0,06 % (m/V) de tacrolimus.

Validation de la méthode de dosage

Afin de valider la méthode de dosage CLHP, la recherche du domaine de linéarité, de la limite de détection et de la reproductibilité est effectuée. Les échantillons de tacrolimus à injecter dans le chromatographe (volume d’injection de 10μL) sont réalisés dans un mélange méthanol/eau (90/10) (V/V) dans une gamme de concentration variant entre 3,6 et 8,4mg/L. Les expériences sont répétées trois fois (n =3). Cette validation consiste à réaliser cinq points correspondant à 60, 80, 100, 120 et 140 % de la concentration cible à 6mg/L.

Étude de la stabilité

Pour étudier la stérilité et la stabilité du collyre au tacrolimus à 0,06 % (m/V), les collyres sont répartis en quatre séries :

collyres fermés à l’abri de la lumière ;
collyres fermés exposés à la lumière ;
collyres ouverts à l’abri de la lumière ;
collyres ouverts exposés à la lumière.

Le premier mois (M1), nous avons mimé l’administration du collyre en faisant couler une goutte du collyre deux fois par jour afin de vérifier si l’ouverture répétée du collyre influe sur la stabilité et la stérilité de la solution. Les contrôles sur les collyres ouverts ont été faits uniquement sur une période de 28jours car c’est la période maximale que nous estimons pour garantir la stérilité d’un collyre exempt de conservateur.

Le premier mois, chaque semaine (j0, j7, j14, j21, j28) un contrôle bactériologique sur un collyre et un contrôle CLHP sur trois collyres de chaque série ont été réalisés. À partir de chaque collyre, nous avons réalisé deux échantillons. Chacun de ces échantillons a été analysé deux fois par CLHP.

Les contrôles bactériologiques et de stabilité seront poursuivis de la même manière pendant quatre mois (M2 à M4) sur les collyres fermés.

Résultats
Contrôle analytique de la préparation

La fabrication de ce collyre a nécessité préalablement la mise au point et la validation analytique d’un dosage du tacrolimus par chromatographie liquide haute performance. Les paramètres analytiques de ce dosage sont réunis dans le Tableau 1.

Stabilité de la préparation

Après stockage du collyre ouvert et fermé, à l’abri de la lumière et exposé à la lumière, la concentration en tacrolimus 0,06 % est restée stable quelle que soit son mode de conservation pendant 28jours (Tableau 2 et Figure 1). Par ailleurs, il existe une stabilité microbiologique. Aucune contamination bactériologique ou mycologique des collyres n’a été constatée après 28jours de conservation et d’utilisation. La Figure 2 montre que la concentration en tacrolimus des collyres fermés et exposés à la lumière est stable trois mois après leurs fabrications (CV5 %). La stérilité des collyres est également confirmée trois mois après leur fabrication.



Figure 1


Figure 1. 

Évolution de la concentration en tacrolimus pendant 28 jours.

Zoom



Figure 2


Figure 2. 

Évolution de la concentration en tacrolimus pendant quatre mois.

Zoom

Discussion

La mise au point de cette nouvelle formulation de collyre au tacrolimus 0,06 % a présenté plusieurs difficultés. L’utilisation d’une spécialité de tacrolimus injectable existante a été exclue du fait de sa forte teneur en éthanol à l’origine d’une mauvaise tolérance (sensations de brûlures voire toxicité épithéliale) et donc d’une observance médiocre. Les gélules de tacrolimus n’ont pas été utilisées du fait de la présence de nombreux excipients. Le choix s’est donc porté sur l’utilisation de la matière première pure.

Différentes formulations assez mal tolérées ont déjà été testées chez l’homme. Reinhard et al. [8] ont mis au point une suspension à base de chlorure de benzalkonium, d’alcool polyvinylique et d’un tampon phosphate ainsi qu’une autre formulation [5] à base d’alcool polyvinylique, de chlorure de benzalkonium, de chlorure de sodium, de di-sodium hydrogénophosphate dodécahydraté, d’hydroxyde de sodium et d’eau. Un autre collyre formulé à 0,02 % de tacrolimus ayant comme excipient de la cyclodextrine a été mal toléré par tous les patients [7]. Wang et al. [23] ont testé un collyre, bien supporté, formulé à partir d’une spécialité de tacrolimus injectable, à base d’huile de ricin, de NaCl, de contactisol, de mercurothiolate et d’eau PPI.

Devant ces différents résultats, le choix de l’excipient dans notre formulation s’est donc porté sur l’huile de ricin. La concentration du collyre à 0,06 % de tacrolimus a été retenue pour notre formulation, son efficacité ayant été démontrée dans deux études cliniques [5, 8]. De plus, les formulations à base d’huile une bonne pénétration intra-oculaire [24]. Concernant le conditionnement du collyre, des flacons en polyéthylène ont été utilisés. Le tacrolimus étant absorbé par les matériaux plastiques en chlorure de polyvinyle, leur utilisation a été exclue.

Enfin, deux problématiques se sont posées lors de la mise au point de la méthode de dosage du collyre. La première concerne la réalisation de l’échantillon. L’utilisation du chloroforme a été abandonnée car il ne permettait pas une dissolution optimale de l’huile de ricin et une récupération totale du tacrolimus dissous. Il entraînait la formation d’un pic chromatographique qui a un temps de rétention trop proche de celui du tacrolimus. Le méthanol a donc été choisi pour réaliser les échantillons et permettre une dissolution optimale. La seconde problématique concerne la technique de prélèvement de l’échantillon. La viscosité de l’huile de ricin entraîne son adhérence aux parois de l’embout de la micropipette et rend difficile la reproductibilité de l’échantillonnage. Le rinçage de la pipette avec du méthanol permet de limiter les pertes en tacrolimus liées aux manipulations. Ces modifications ont donc permis d’obtenir des résultats, répétables et exploitables. La stabilité chimique et bactériologique du collyre, quelles que soient ses conditions de conservation et l’absence d’obligation de protection du collyre de la lumière, facilite son utilisation par les patients.

Conclusion

La fabrication et le conditionnement du collyre au tacrolimus à 0,06 % sont encadrés par de nombreux contrôles permettant d’en garantir la stérilité et la stabilité. Le procès nécessite une étape de mélange ainsi qu’une filtration sous vide qui sont les étapes de fabrication les plus longues. Leur durée est fonction du volume de médicaments préparés. Quant au contrôle microbiologique, il nécessite un délai incompressible de 15 jours. Pour pallier ces inconvénients, la préparation de plusieurs unités de collyre en même temps ainsi qu’un suivi soigneux du stock et des péremptions permettent de tenir cette préparation toujours en permanence à disposition des patients. Ces collyres, quelle que soit leur mode de conservation sont stables et stériles 28jours après ouverture et peuvent être conservés trois mois après leur fabrication.

Des études de tolérance et efficacité du collyre chez l’homme sont en cours dont les premiers résultats sont encourageants avec peu d’effets secondaires rapportés par les patients. À plus long terme, un essai en double insu comparant l’efficacité du collyre au tacrolimus à celle du collyre à la ciclosporine 2 % serait utile pour situer ce dernier dans l’arsenal thérapeutique dans la prévention et le traitement du rejet de greffes de cornée. Une attention particulière devra être portée sur la tolérance à court, moyen et long terme de cette nouvelle formulation.

Déclaration d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêt en relation avec cet article.

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