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Krox20 heterozygous mice: A model of aortic regurgitation associated with decreased expression of fibrillar collagen genes - 04/03/16

Doi : 10.1016/j.acvd.2015.10.002 
Alexis Théron a, b, c, 1, Gaëlle Odelin a, b, 1, Emilie Faure a, b, Jean-François Avierinos a, b, d, Stéphane Zaffran a, b,
a Aix Marseille Université, GMGF UMR_S910, Faculté de Médecine, 27, boulevard Jean-Moulin, 13385 Marseille, France 
b Inserm, U910, Faculté de Médecine, 13385 Marseille, France 
c AP–HM, Hôpital de la Timone, Département de Chirurgie Cardiaque, 13005 Marseille, France 
d AP–HM, Hôpital de la Timone, Département de Cardiologie, 13005 Marseille, France 

Corresponding author at: Aix Marseille Université, Inserm, GMGF UMR_S910, Faculté de Médecine, 27, boulevard Jean-Moulin, 13385 Marseille, France.

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Summary

Background

The mechanism involved in the onset of aortic valve (AoV) disease remains unclear despite its poor prognosis and frequency. Recently, we reported that Krox20 (EGR2 in humans) is involved in AoV development and dysfunction.

Aim

Analyze Krox20 heterozygous mice (Krox20+/−) to discover whether incomplete expression of Krox20 can cause valvular diseases.

Methods

Transcriptional levels of Col1a2/COL1A2 and Krox20/EGR2 in AoVs from Krox20+/− mice and human patients operated on for severe aortic regurgitation were evaluated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). Human control valves were obtained from three transplanted patients without AoV disease. Twenty-one heterozygous Krox20+/− mice were compared with 35 controls at different ages. Three independent measurements of valve thickness were performed on magnified tissue sections using Image J software. In vivo valve structure and function were evaluated using the high-frequency Vevo® 2100 echocardiogram.

Results

qRT-PCR analysis using AoVs from patients with severe aortic regurgitation showed a decrease in EGR2 expression associated with significant downregulation of COL1A2 expression (P<0.05). Similar results were observed in the AoVs of Krox20+/− mice. Anatomical examination revealed that incomplete invalidation of Krox20 caused significant thickening of the aortic leaflet compared with controls (145±22 vs. 75±24μm; P=0.01). Within the mutant group, this thickening worsened significantly over time (Krox20+/− mice aged>7 vs.<7months: 136±48 vs. 102±41μm; P<0.001). Moreover, the aortic leaflets of embryonic day 18.5 Krox20+/− embryos were significantly more thickened than those from controls, suggesting that this disease begins during embryonic development. Echo-Doppler analysis showed a significant increase in AoV dysfunction in heterozygous versus control mice (53% vs. 17%; P<0.001), suggesting a tight relationship between valve architecture and function. Morphometric analysis revealed that the most severe AoV dysfunction was always associated with the most thickened valves. Classic histological analysis revealed that mutant AoVs had extracellular matrix disorganization, with features of human myxomatous degeneration, including excess of proteoglycan deposition in spongiosa and reduction of collagen fibre in fibrosa, but no calcification.

Conclusion

Decreased expression of Krox20 in mice causes degeneration of the aortic leaflets and disorganization of the extracellular matrix, causing valvular dysfunction.

Le texte complet de cet article est disponible en PDF.

Résumé

Contexte

Les mécanismes impliqués dans la survenue des valvulopathies aortiques restent à ce jour non élucidés malgré leur fréquence et leur mauvais pronostic. Récemment, nous avons montré que Krox20 (EGR2 chez l’Homme) joue un rôle important dans la valvulogenèse aortique et la survenue de dysfonction valvulaire.

Objectif

Notre objectif était de savoir si la perte d’un allèle de Krox20 pouvait conduire à un défaut valvulaire.

Méthodes

Nous avons mesuré par PCR quantitative en temps réel (QPCR) le niveau d’expression du gène Col1a2/COL1A2 et de Krox20/EGR2 au sein de valves aortiques provenant de souris hétérozygotes Krox20+/− et de patients opérés d’insuffisance aortique sévère et sur des valves témoins issues de patients transplantés indemnes de valvulopathie aortique. Nous avons comparé un groupe de souris hétérozygotes Krox20+/− (n=21) à un groupe témoin (n=35) à différents âges de vie. Les échocardiographies ont été réalisées à l’aide d’un échocardiogramme Vevo® 2100. Les coupes histologiques ont été obtenues après inclusion des échantillons de cœurs murins en paraffine et section au microtome. L’épaisseur valvulaire a été mesurée à trois reprises grâce au logiciel Image J software.

Résultats

L’analyse par QPCR révèle une réduction de l’expression du gène EGR2 associée à une diminution significative de COL1A2 (p<0,05) dans les valves aortiques de patients opérés de valvulopathie aortique concordant avec une diminution de Col1a2 au sein de valves aortiques de souris mutantes. L’examen anatomique montre que l’invalidation incomplète de Krox20 conduit à un épaississement valvulaire significatif par rapport au groupe témoin (145±22 vs 75±24μm ; p=0,01). L’épaississement de la valve aortique s’aggrave au cours du temps (âge>7 mois versus<7 mois, 136±48 vs 102±41μm ; p<0,001). De plus, les feuillets valvulaires d’embryons mutants sont significativement plus épais que les feuillets des embryons témoins à E18,5, suggérant une apparition de la dégénérescence valvulaire dès la vie embryonnaire. L’analyse échocardiographique montre une augmentation significative de valvulopathies aortiques chez les souris Krox20+/− (53 % vs 17 % ; p<0,001), suggérant une relation étroite entre architecture valvulaire et dysfonctionnement. L’analyse morphométrique des échantillons démontre que les valvulopathies les plus sévères sont associées aux épaississements valvulaires les plus importants. Enfin, les feuillets aortiques des souris Krox20+/− présentent une désorganisation de la matrice extracellulaire évocatrice de dégénérescence myxoïde incluant un excès de protéoglycans dans la spongiosa, une raréfaction des fibres de collagène dans la fibrosa et une absence de calcification.

Conclusion

Nos résultats montrent que la diminution de l’expression de Krox20 chez la souris est à l’origine d’une dégénérescence des feuillets aortiques et d’une désorganisation de la matrice extracellulaire responsable de dysfonction valvulaire.

Le texte complet de cet article est disponible en PDF.

Keywords : Aortic valve regurgitation, Krox20, Heart valve, Extracellular matrix, Collagens

Mots clés : Régurgitation aortique, Krox20, Valve cardiaque, Souris, Matrice extracellulaire, Collagènes

Abbreviations : AoV, ECM, LV, oim, Postn, qRT-PCR, RNA


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Vol 109 - N° 3

P. 188-198 - mars 2016 Retour au numéro

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