Développer une procédure d’extraction faisant appel aux sels QuEChERS et permettant une recherche et un dosage rapides de benzodiazépines pour des applications hospitalières et médicolégales.

Les 42 molécules suivantes ont été considérées : 24 benzodiazépines commercialisées, 10 de leurs métabolites et 8 benzodiazépines de synthèse (diclazépam, étizolam, deschloroétizolam, flubromazépam, flubromazolam, méclonazépam, clonazolam et nifoxipam). Le système chromatographique a associé deux pompes UHPLC Nexera X2 LC-30AD, un four CTO-20AC, un passeur d’échantillons Nexera X2 SIL-30AC (Shimadzu, France) et une colonne Pinnacle DB PFPP (50mm×2,1mm et de granulométrie 1,9μm ; Restek^®). La détection a été réalisée au moyen d’un spectromètre de masse en tandem 8050 (Shimadzu^®, France). La procédure, destinée à être utilisée sous accréditation COFRAC, a été validée selon les exigences de la norme ISO 15189, pour des applications dans le sang total, le sérum et l’urine (à l’exception des 8 benzodiazépines de synthèse). Les résultats obtenus pour cette nouvelle procédure ont été comparés à ceux obtenus avec la procédure utilisée jusqu’alors dans le service (CL-SM/SM après extraction en phase solide) pour un échantillon de 50 patients.

Le protocole d’extraction retenu a été le suivant : à 100μL de matrice sont ajoutés 200μL d’acétonitrile. Après agitation au vortex et 10minutes au congélateur, environ 40mg de sels QuEChERS Mix I (4g MgSO₄, 1g NaCl, 0,5g Na₂H citrate·1,5 H₂O, 1g Na₃ citrate 2 H₂O) sont ajoutés, puis la solution est agitée au vortex et mise à centrifuger pendant 10minutes à 13 000 tours/min. Finalement, 50μL de surnageant sont dilués dans 150μL de phase mobile aqueuse, avant injection de 5μL dans le système CL-SM/SM. Le temps d’acquisition est de 6,3min. Les 24 benzodiazépines et leurs 10 métabolites ont satisfait aux exigences de la procédure de validation pour une gamme s’étendant de 2 ou 5μg/L à 2000μg/L, après introduction de 10 étalons internes deutérés dans la méthode. L’extraction de 6 points de gamme, 2 contrôles et 10 échantillons de patients, nécessitent 30 à 45minutes de préparation, permettant un rendu des résultats en moins de 3heures pour une telle série. Dans un contexte de toxicologie hospitalière, un résultat patient est rendu en moins d’une heure. Parmi les 50 échantillons de comparaison, la nouvelle procédure a permis de détecter 19 composés de plus que l’ancienne procédure : bromazépam et ses métabolites (3-OH Bromazépam et 2(2-amino-5-bromobenzoyl) pyridine), clonazépam, diazépam, flunitrazépam, nordazépam, oxazépam et témazépam (à chaque fois des concentrations très faibles).

Basée sur une extraction simple combinant acétonitrile et sels QuEChERS, cette méthode de CL-SM/SM a permis de diminuer très significativement le temps de rendu des résultats, tout en préservant une très bonne capacité à mettre en évidence une exposition à des benzodiazépines.