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Utilisation de la digital PCR pour quantifier le nombre de copies d’ADN ribosomal 28S d’Aspergillus fumigatus : impact pour le diagnostic clinique - 16/06/16

Doi : 10.1016/j.mycmed.2016.04.011 
A. Alanio , A. Sturny-Leclère, S. Bretagne
 Unité de mycologie moléculaire, CNRS URA3012, Institut Pasteur, France 

Auteur correspondant.

Resumen

Introduction

La PCR digitale permet une quantification absolue des acides nucléiques de façon indépendante de l’efficacité de PCR. Son principe est de répartir l’ADN dans plusieurs milliers gouttelettes (10°000 à 20°000) réalisant autant de PCR indépendantes. La détection de la réaction de PCR se fait en point final, basé sur la détection d’une fluorescence. Les résultats s’analysent en comptant le nombre de gouttelettes positives par rapport à leur nombre total et permet ensuite de calculer un nombre de copie/μL d’ADN détecté. Dans le cas des cibles répétées et particulièrement celles répétées en tandem, il est d’usage d’utiliser une digestion enzymatique de l’ADN pour libérer chaque copie de leurs voisines et éviter que deux copies ne soient présentes dans une gouttelette. Le nombre de copie estimée de l’ADN ribosomal 28S (ADNrib) a été estimé à 35 lors du séquençage d’Aspergillus fumigatus.

Objectif

L’objectif de l’étude était de quantifier le nombre de copies d’ADNrib (28S) de différents isolats d’Aspergillus fumigatus en comparaison à un gène unique du génome (FKS1) et de comparer l’effet de la digestion enzymatique sur les ADN de ces souches à celui de la digestion d’ADNrib circulant issus de sérums de patients avec aspergillose invasive.

Méthodes

La souche de référence AF293 (souche séquencée en 2005) et 9 isolats cliniques de génotypes et de groupes génétiques différents ont été sélectionnés et extraits de manière standardisée (MagNapure, Roche). Le sérum de dix patients atteints d’aspergillose invasive ont été sélectionnés. Chaque ADN a subit une digestion enzymatique (EcoRI et HaeIII après avoir vérifier l’absence de site de restriction dans la région amplifiée) et comparé au même ADN sans digestion. Les PCR 28S de Challier et al. [1] et FKS1 de Herrera et al. [2] ont été utilisée en duplex. Les résultats de digitale ont été comparés à la PCR quantitative classique.

Résultats

Le nombre de copie de 28S variait de 61 à 86 copies (médiane : 75) en fonction des souches cliniques. L’ADN d’Af293 évaluée à 35 copies a été retrouvé dans nos expériences à 69±7 copies. En absence de traitement enzymatique, le nombre de copies était significativement plus bas et variait de 34 à 76 copies (médiane : 57) (p=0,003). À l’inverse, aucun impact significatif du traitement enzymatique n’a été observé pour les 10 ADN circulants avec une médiane de 0,5 copies/μL sans digestion versus 0,85 copies/μL d’ADNrib avec digestion (p=0,19). Ces différences ont été observées dans les mêmes proportions en qPCR.

Conclusion

Ces données générées en digital PCR permettent de mettre en évidence que l’ADN circulant au cours de l’aspergillose invasive serait de moins grande taille que l’ADN extrait de souches, renforçant l’hypothèse que l’ADN aspergillaire est circulant et libre.

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