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Pneumocystis sp. in bats evaluated by qPCR - 05/03/13

Doi : 10.1016/j.mycmed.2012.11.002 
E.M. Cavallini Sanches a, b, c, , L. Ferreiro a, C.P. Andrade d, S.M. Pacheco e, L.L. Almeida d, A. Spanamberg a, G. Wissmann f
a Setor de Micologia Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil 
b Hospital Universitário Julio Muller, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil 
c Secretaria de Estado de Saúde, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil 
d Setor de Patologia Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil 
e Instituto Sauver, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil 
f Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil 

Corresponding author. Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves n. 9090. CEP 91540-000 Porto Alegre, RS, Brazil.

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Summary

Molecular techniques have revealed a high prevalence of Pneumocystis colonization in wild mammals. Accurate quantification of Pneumocystis sp. is essential for the correct interpretation of many research experiments investigating this organism. The objectives of this study were to detect the presence of Pneumocystis sp. in bats by qPCR, and to distinguish colonization from infection. Probes and primers for real time PCR (qPCR) were designed based on the gene of major surface glycoprotein (MSG) of Pneumocystis sp., in order to analyze 195 lung tissue samples from bats captured (2007–2009). All samples were also analyzed by nested PCR, using oligonucleotide primers designed for the gene encoding the mitochondrial small subunit rRNA (mtSSU rRNA) to confirm the results. The qPCR assay was standardized using a standard curve made with the DNA extracted from bronchoalveolar lavage positive for Pneumocystis jirovecii. The average Ct was found to be between 13 and 14 (calibration curve) for the detection of infection with Pneumocystis sp. and above these values for colonization. It was considered as negative samples the ones that had Ct values equal to 50. Out of the total 195 samples, 47 (24.1%) bat lung DNA samples were positive for Pneumocystis sp. by qPCR. The most common bat species found were: Tadarida brasiliensis (23.4%), Histiotus velatus (17.0%), Desmodus rotundus (14.9%) and Molossus molossus (8.5%). The average cycle threshold of the positive samples (bats) was 25.8 and standard deviation was 1.7. The DNA samples with Ct values greater than 14 suggest that these animals might be colonized by Pneumocystis sp. Results obtained in this study demonstrated the usefulness of the qPCR procedure for identification of Pneumocystis sp. and for distinction between its colonizing or infectious status in bats.

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Résumé

Les techniques moléculaires ont révélé une grande prévalence de Pneumocystis chez les mammifères sauvages. Quantifier précisément la présence de Pneumocystis est essentielle pour une interprétation adéquate des résultats obtenus lors de son investigation. Les objectifs de cette étude étaient de détecter par PCR en temps réel la présence de Pneumocystis sp. chez les chauves-souris et de pouvoir faire la distinction entre une simple colonisation et une infection. Les sondes nucléiques et les amorces ont été synthétisées à partir du gène de la glycoprotéine majeure de surface (MSG) de Pneumocystis sp. Les principales espèces de chiroptères étaient les suivantes: Tadarida brasiliensis (23,4 %), Histiotus velatus (17,0 %), Desmodus rotundus (14,9 %) et Molossus molossus (8,5 %). Le pourcentage d’échantillons positifs a été de 24,1 % avec une moyenne du cycle seuil se situant à 25,8 et un écart-type de 1,7. Étaient considérés comme négatifs, les échantillons qui avaient des valeurs de Ct égales à 50. Tous les 195 échantillons ont également subi une amplification par qPCR et PCR nichée ciblée sur les fragments des gènes mtSSU rRNA. Parallèlement, ces expériences (pPCR et PCR nichée) menées sur des échantillons de liquides de lavage bronchoalvéolaire, obtenus de patients ayant une pneumonie à Pneumocystis (PcP) diagnostiquée cliniquement, ont montré un Ct moyen compris entre 13 et 14 lors d’une infection et au-dessus lors d’une colonisation. De cette manière, sur un total de 195 échantillons d’ADN extraits des tissus pulmonaires de chauves-souris, 47 extraits amplifiés par qPCR ont révélé une colonisation à Pneumocystis sp. Les résultats obtenus au cours de cette étude ont démontré l’intérêt de la technique PCR en temps réel dans l’identification de Pneumocystis sp. et dans la distinction du caractère colonisateur ou infectieux de sa présence.

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Keywords : Pneumocystis spp., Bats, qPCR, Colonization, Major surface glycoprotein (MSG)

Mots clés : Pneumocystis sp., Chauve-souris, PCR en temps réel, Colonisation, Protéine de surface majeure (PSM)


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© 2013  Publicado por Elsevier Masson SAS.
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Vol 23 - N° 1

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