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Détection et quantification de la variabilité génétique de cyp51a chez Aspergillus fumigatus dans des cultures primaires de prélèvements respiratoires - 05/06/15

Doi : 10.1016/j.mycmed.2015.02.016 
E. Sitterlé a, , b , C. Rodriguez c, d, J.M. Costa b, e, N. Fauchet f, E. Dannaoui b, g, F. Botterel a, b
a Unité de Mycologie, Département de Microbiologie, Groupe hospitalier Henri-Mondor Albert-Chenevier, AP–HP, DHU VIC Université Paris-Est, Créteil, France 
b Dynamyc, UPEC, ENVA, Département de Microbiologie, Groupe hospitalier Henri-Mondor Albert-Chenevier, AP–HP, DHU VIC Université Paris-Est, Créteil, France 
c Unité de Virologie, Département de Microbiologie, Groupe hospitalier Henri-Mondor Albert-Chenevier, AP–HP, DHU VIC Université Paris-Est, Créteil, France 
d Plateforme de Séquençage Haut Débit, IMRB, Créteil, France 
e Laboratoire Cerba, Saint-Ouen-L’aumone, France 
f Laboratoire de Microbiologie, CHI de Créteil, Créteil, France 
g Service de Parasitologie, Hôpital Georges-Pompidou, AP–HP, Paris, France 

Auteur correspondant.

Resumen

Introduction

La résistance d’Aspergillus fumigatus aux azolés est devenue ces dernières décennies un problème émergent. Au laboratoire, la détection de la résistance se fait de façon phénotypique par détermination des CMIs éventuellement suivie d’une caractérisation génotypique des mutations se trouvant dans le gène cyp51a. Cependant, l’ensemble de ces techniques est effectué à partir d’une colonie de l’isolat, ce qui ne reflète pas les populations fongiques présentes au sein d’un prélèvement de patient. Il est possible que dans les prélèvements respiratoires existent des populations d’A. fumigatus différentes, résistantes ou non. Dans les populations résistantes, il est également possible qu’il existe des variants majoritaires du gène cyp51a et d’autres minoritaires. L’objectif de ce travail était de mettre en place et de valider une technique sensible de quantification de différents variants du gène cyp51a d’A. fumigatus puis d’analyser la faisabilité de cette technique sur des cultures primaires de prélèvements respiratoires.

Matériel

Un plasmide contenant une copie du gène cyp51a sauvage (Pwt) associé à son promoteur et un autre contenant des mutations de résistance connues (Pm) ont été synthétisés, puis mélangés en proportion variables (0 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 100 %) pour déterminer les limites de détection et de quantification de la méthode. En parallèle, 32 cultures primaires provenant de prélèvements respiratoires de patients ont été analysées après extraction de l’ADN fongique sur le QIASymphony©.

Méthodes

Le gène cyp51a ainsi que son promoteur ont été amplifiés par PCR en 5 fragments puis préparés pour le séquençage à haut débit selon le protocole du fournisseur pour les séquenceurs GS (Roche/454). Les séquences générées ont été analysées à l’aide d’un logiciel maison « PyroMIC© » (IDDN.FR.001.400018.000.S.P.2014.000.31230) permettant la quantification des mutations du gène cyp51a et de son promoteur. Le logiciel QuRe© a été utilisé pour effectuer une reconstruction du gène et analyser la diversité de cyp51a par approche haplotypique.

Résultats

Plus de 100 000 séquences de bonne qualité (longueur moyenne : 439 pb) ont été générées et utilisées pour la validation technique qui ont permis d’établir une limite de détection à 0,4 % et une limite de quantification de 1,3 %. En parallèle, plus de 400 000 séquences ont été produites à partir des échantillons de culture (couverture de 2625X en moyenne). Parmi ces échantillons, 2 présentaient au moins 2 variants différents de cyp51a dont l’un présentait des variants contenant des mutations de résistance connue.

Conclusion

Nous avons pu mettre en place une méthode d’analyse originale et sensible de la diversité chez A. fumigatus. Cette méthode a permis de montrer qu’une variabilité de cyp51a existait au sein des cultures primaires de prélèvements respiratoires y compris pour des mutations de résistance, ce qui pourrait impacter le succès de traitement des patients ayant ces variabilités du gène.

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Vol 25 - N° 2

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