Construction d’une souche de Candida lusitaniae génétiquement modifiée pour l’étude des mutations de résistance aux échinocandines - 31/08/15
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Resumen |
Introduction |
Les échinocandines altèrent la synthèse de la paroi fongique en inhibant la β-(1-3)-D-glucane synthétase, codée par les gènes FKS. Des mutations dans deux régions « Hot Spot » (HS) très conservées des gènes FKS ont été décrites dans des cas de résistances acquises aux échinocandines chez les levures Candida. Les souches résistantes sont caractérisées au niveau phénotypique (mesure des CMIs et de l’activité enzymatique) et génotypique (séquençage généralement limité aux régions HS). Faute d’un bon modèle biologique, et à cause de la grande taille des gènes FKS (5–6kb), peu de mutations ont été caractérisées par remplacement d’allèle chez les levures Candida.
L’objectif de ce travail est de construire une souche de Candida lusitaniae génétiquement modifiée pour exprimer des allèles FKS mutés.
Matériel et méthodes |
C. lusitaniae est une levure haploïde appartenant au clade CTG des Candida. La souche utilisée est une souche auxotrophe pour le tryptophane et l’uracile (6936 ura3Δ990 trp1Δ798), dans laquelle des demi-marqueurs d’auxotrophie trp1 et ura3 ont été implantés dans les régions 5′ et 3′ du gène FKS1.
Le remplacement de l’allèle résident sauvage FKS+ est effectué par l’apport de deux fragments d’ADN qui vont reconstituer des marqueurs d’auxotrophie fonctionnels de part et d’autre du gène FKS. Un fragment porte la partie 3′ du gène TRP1 et la partie 5′ du gène FKSmut, et un fragment porte la partie 3′ du gène FKSmut et la partie 5′ du gène URA3. Ces deux fragments sont co-transformés dans la souche réceptrice, recombinent in cellulo pour former un seul fragment qui s’intègre au locus FKS par double crossing-over. Cette recombinaison aboutit à une souche prototrophe exprimant l’allèle FKSmut.
Résultats |
Trois mutations déjà connues du gène FKS ont été introduites pour la validation du modèle : les mutations F641V et S645P dans HS1 et R1361G dans HS2. À l’issue du remplacement d’allèle, les CMIs aux échinocandines ont été déterminées par la méthode des E-Test et par dilution en milieu liquide.
Conclusion |
Cette souche de C. lusitaniae génétiquement modifiée pour permettre l’expression d’un allèle FKS complet ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude d’une grande diversité de mutations, notamment dans les régions hors HS, et pour l’expression hétérologue de différents allèles de Candida spp. chez C. lusitaniae.
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Vol 25 - N° 3
P. 230-231 - septembre 2015 Regresar al númeroBienvenido a EM-consulte, la referencia de los profesionales de la salud.
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