L’objet de cette présentation est d’expliquer les principes physiques de trois méthodes permettant de réaliser en temps réel des images de tissus vivants à l’échelle cellulaire. La microscopie confocale repose sur le balayage simultané du tissu par une tache d’éclairement et une ouverture confocale : cette dernière permet une résolution latérale proche du micromètre, à condition de conférer à l’optique une ouverture numérique élevée. La source utilisée en microscopie biphotonique est un laser dont la puissance n’est suffisante pour exciter la réponse non-linéaire spécifiquement détectée que dans un volume microscopique, qui seul contribue à la construction de l’image. Pour ces deux méthodes, les fluorophores naturels des tissus sont en trop faible concentration pour donner un signal suffisant, aussi des fluorophores doivent-ils être ajoutés soit localement, soit au corps entier. Il est avantageux d’associer ces fluorophores à des biomolécules qui ciblent des processus pathologiques, pour augmenter la spécificité des diagnostics. Enfin la tomographie à cohérence optique (ou OCT pour Optical Coherence Tomography) est une technique d’imagerie haute résolution qui, en utilisant une source optique à très faible longueur de cohérence, produit sans recourir à un fluorophore une image interférométrique du tissu avec une profondeur de champ et une résolution latérale de l’ordre de quelques micromètres. Bien que les techniques actuelles d’optique et de micro-endoscopie permettent théoriquement de réaliser des images à l’échelle d’une couche cellulaire, le contraste et la stabilité des images obtenues doivent faire l’objet de mises au point très spécifiques avant que leur signification ne puisse être établie en regard des techniques classiques de biopsie.

The purpose of this presentation is to explain the physical principles underlying the three main methods used to obtain images of living tissues at the cellular scale. In confocal microscopy, the tissue of interest is illuminated and scanned through a confocal aperture ; a lateral resolution close to 1 μm can be obtained with high numerical aperture. Multiphoton microscopy uses a high-power short-pulse laser with instantaneous irradiance sufficient to excite fluorescence in a very small focal volume. The concentration of natural tissue fluorophores is too low to obtain an adequate signal, so exogenous fluorophores have to be added, either locally or through the body. These fluorophores can be conjugated to a variety of biomolecules that target specific disease processes, thereby increasing diagnostic specificity. Finally, OCT (optical coherence tomography) provides high-resolution images of entire tissue volumes by using a broadband source and an interferometric configuration ; the depth of field and lateral resolution are both on the micrometer scale. These methods allow images to be obtained at the cellular level, but image contrast and stability require specific adjustment for their significance to be established with respect to conventional biopsy methods.