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Triple-costimulatory GD2-CAR T cells incorporating CD28, 4–1BB and CD27 mediate potent cytotoxicity and reduce exhaustion in solid tumour models - 20/09/26

Doi : 10.1016/j.biopha.2026.119897 
Jatuporn Sujjitjoon a, ⁎ , Katesara Kongkla a, Pornpimon Yuti a, Nunghathai Sawasdee a, Krissada Natungnuy a, Naravat Poungvarin b, Pa-thai Yenchitsomanus a, ⁎
a Siriraj Center of Research for Cancer Immunotherapy (SiCORE-CIT), and Division of Molecular Medicine, Research Department, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand 
b Department of Clinical Pathology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand 

⁎ Corresponding authors.

Abstract

Disialoganglioside (GD2) is a validated tumour-associated antigen for chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy; yet most GD2-CAR constructs carry limited costimulatory signaling, which may constrain efficacy and durability. We engineered humanised hu3F8-based GD2-CAR T cells bearing dual or triple costimulatory domains— GD2–28BBζ (CD28/4–1BB), GD2–28.27ζ (CD28/CD27) and GD2–28BB27ζ (CD28/4–1BB/CD27) — and compared their in-vitro function against GD2-positive neuroblastoma (SK-N-AS), lung adenocarcinoma (A549) and retinoblastoma (Y79 and WERI-Rb-1) cells. All three mediated antigen-specific cytotoxicity against GD2-positive lines while sparing GD2-negative targets. At the lowest effector-to-target ratio, GD2–28BB27ζ T cells retained significantly killing of SK-N-AS cells where the third-generation constructs did not, indicating potent cytotoxicity under limiting effector conditions, whereas GD2–28.27ζ T cells showed the greatest proliferation, reaching significance against WERI-Rb-1. On antigen engagement, GD2–28BB27ζ T cells sustained cytotoxicity while secreting less IL-2, IFN-γ and TNF-α than the other constructs, indicating an uncoupling of lytic function from effector-cytokine output. Under serial tumour rechallenge, GD2–28BB27ζ T cells maintained cytolytic function, acquired fewer activation and exhaustion markers (CD69, TIM-3 and, versus GD2–28BBζ, LAG-3; PD-1 unchanged), better preserved their CAR⁺ population, and retained a larger naïve-like (CD45RO⁻CD62L⁺) subset than the other constructs. Together, these in-vitro findings indicate that combining CD28, 4–1BB and CD27 within a single CAR confers potent cytotoxicity with low effector-to-target ratios, lower effector-cytokine output, reduced exhaustion-marker acquisition and greater phenotypic durability, identifying GD2–28BB27ζ as a promising configuration for GD2-positive tumours that warrants in vivo evaluation.

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Graphical Abstract




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Highlights

•
GD2-CAR T cells with CD28, 4–1BB and CD27 costimulation were engineered.
•
GD2–28BB27ζ retained cytotoxicity at low effector-to-target ratios.
•
It sustained cytotoxicity while secreting less IL-2, IFN-γ and TNF-α.
•
On rechallenge it gained fewer exhaustion markers with better CAR + expansion.
•
Triple costimulation uncouples cytotoxicity from cytokine output.

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Keywords : Chimeric antigen receptor, CAR T cell, GD2, GD2-CAR T cell, Solid tumour


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