Le séquençage de nouvelle génération (NGS) occupe désormais une place centrale en pathologie tumorale, permettant la caractérisation simultanée de multiples altérations somatiques à visée diagnostique, pronostique et théranostique. Les stratégies disponibles (des panels ciblés aux approches globales [ whole exome sequencing  – WES, whole genome sequencing  – WGS]) ainsi que les méthodes d’enrichissement et les plateformes de séquençage, sont variées et doivent être choisies en fonction de la question clinique posée, des altérations recherchées et des contraintes analytiques. La fiabilité du résultat repose sur la maîtrise de l’ensemble de la chaîne analytique, depuis la préparation des librairies jusqu’au traitement bioinformatique et à l’interprétation des variants. Cette fiche thématique décrit les principales étapes du flux NGS, les paramètres conditionnant les performances analytiques (profondeur, couverture, fréquence allélique des variants) ainsi que les limites inhérentes aux différentes stratégies et les pièges interprétatifs liés à la qualité du matériel tumoral. L’intégration des résultats du NGS au contexte morphologique et clinique reste indispensable, et que leur interprétation constitue un acte médical à part entière.

Next-generation sequencing (NGS) has become a cornerstone of tumor pathology, enabling the simultaneous characterization of multiple somatic alterations for diagnostic, prognostic, and theragnostic purposes. The available strategies (from targeted gene panels to comprehensive approaches such as whole exome or whole genome sequencing) as well as enrichment methods and sequencing platforms, must be selected according to the clinical question, the expected alterations, and the analytical constraints. The reliability of results depends on mastering the entire analytical workflow, from library preparation to bioinformatic processing and variant interpretation. This article describes the key steps of the NGS workflow, the parameters governing analytical performance (sequencing depth, coverage, and variant allele frequency) as well as the limitations inherent to each strategy and the interpretative pitfalls associated with tumor material quality. It emphasizes that integrating NGS results within the morphological and clinical context remains essential, and that variant interpretation constitutes a full medical act in its own right.