Article

PDF
Access to the PDF text
Service d'aide à la décision clinique
Advertising


Free Article !

Journal de Gynécologie Obstétrique et Biologie de la Reproduction
Vol 32, N° 4  - juin 2003
pp. 363-367
Doi : JGYN-06-2003-32-4-0368-2315-101019-ART9
Première naissance après un diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) pratiqué sur embryons décongelés
 
Masson
Tirés à part :
N.Frydman[1] , à l'adresse ci-dessus.

[4] E-mail :nelly.frydman@abc.ap-hop-paris.fr

 

Objectifs. Rapporter la prise en charge de 3 couples pour lesquels un diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) sur embryons congelés et décongelés a été réalisé.

Patients et méthodes. Après acceptation de l'indication de DPI, trois couples (C1, C2, C3) qui avaient des embryons congelés dans d'autres centres d'AMP ont été pris en charge. Les biopsies étant pratiquées à J3 les embryons ont été décongelés la veille et gardés en culture jusqu'à J3 (couples C1 et C3) ou décongelés le jour même de la biopsie (couple C2). L'analyse génétique a été réalisée par PCR multiplexe (couple C1) ou par Hybridation in situ (couple C2 et C3). Les transferts embryonnaires ont eu lieu le troisième ou quatrième jour de développement.

Résultats. Sur les dix embryons décongelés, huit ont été biopsiés et cinq embryons indemnes ont été transférés. Deux grossesses biologiques et une clinique ont été obtenues donnant lieu à une naissance.

Conclusions. Le DPI peut être proposé aux couples à risque de transmission d'une maladie génétique grave et incurable et possédant des embryons congelés.

Diagnostic génétique pré-implantatoire , Embryons congelés , Translocation , Maladie monogénique

First birth after preimplantation genetic diagnosis performed on thawed embryos.

Objective. To report the birth of the first infant conceived after preimplantation genetic diagnosis (PGD) performed on frozen-thawed embryos in our PGD center.

Patients and methods. Three couples (C1, C2 and C3) who had frozen embryos from a previous in vitro fertilization attempt were enrolled in our PGD program. Embryos were thawed one day before the biopsy procedure for the couples C1 and C3 and the day of the biopsy for the couple C2. The single cell genetic analysis was performed by a multiplex PCR for the couple C1 and by fluorescent in situ hybridization for the couples C2 and C3. The embryos transfers were carried out on the third or fourth day.

Results. Out of ten thawed embryos, eight were biopsied and five were transferred during three embryos transfers. Two biochemical and one ongoing pregnancy were obtained yielded one birth.

Conclusions. PGD may be offered to couples at risk of transmission of a serious and incurable genetic disease and having frozen embryos.

Preimplantation genetic diagnosis , Frozen embryos , Translocation , Single gene disease

Le diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) est basé sur l'analyse du contenu génétique d'embryons humains obtenus par fécondation in vitro (FIV). Bien que connu scientifiquement depuis 10 ans [1], la législation française n'a autorisé que récemment (juillet 1999) la pratique de cette activité dans trois centres. Seuls les couples susceptibles de transmettre une pathologie génétique d'une particulière gravité et reconnue comme incurable au moment du diagnostic peuvent avoir recours au DPI.

N'ayant pu bénéficier du DPI dans le passé, un certain nombre de couples à risque génétique et infertiles ont eu recours à une fécondation in vitro acceptant la réalisation d'un diagnostic prénatal et une éventuelle interruption de grossesse en cas d'atteinte foetale. Au cours de ces fécondations in vitro, tous les embryons n'ont pas été transférés et certains d'entre eux ont été congelés. L'autorisation légale de juillet 1999 a permis à un certain nombre de ces couples risquant de transmettre une maladie génétique de pouvoir bénéficier d'un DPI pratiqué alors, sur embryons surnuméraires congelés puis décongelés.

Dès lors, se posait la question de savoir si le processus de congélation/décongélation associé à la biopsie d'un ou de deux blastomères était susceptible d'affecter la viabilité embryonnaire.

Nous rapportons ici la prise en charge de 3 couples pour lesquels un DPI sur embryons congelés et décongelés a été réalisé en raison d'un risque de transmission d'une maladie génétique.

Patients et méthodes

Patients

De janvier 1999 à juillet 2002, nous avons reçu en consultation à l'hôpital Antoine-Béclère, 334 couples en vue d'un DPI. Il s'agit d'une consultation spécialisée pluridisciplinaire constituée d'un clinicien, d'un biologiste de la reproduction, d'un médecin psychiatre, d'un généticien moléculaire ou d'un cytogénéticien et d'une sage-femme coordonnatrice. Chaque consultation est précédée d'une réunion d'informations d'une heure au moins sur le DPI qui réunit l'ensemble des patients. Parmi ceux-ci 3 couples (C1, C2, C3) avaient des embryons congelés dans d'autres centres d'Assistance Médicale à la Procréation qui ont été transférés dans notre laboratoire.

Après acceptation de l'indication de DPI, un bilan préalable a été prescrit qui comprend une actualisation des sérologies du couple et une étude de la cavité utérine habituellement par hystéroscopie. Un entretien psychologique a été systématiquement évoqué au cours de la première consultation.

Le couple C1 avait déjà bénéficié de trois tentatives d'ICSI en raison de l'existence d'une oligoasthénotératozoospermie, sans qu'aucune grossesse ne survienne. La patiente présentait de plus un risque de transmission de la myopathie de Duchenne (délétion de l'exon 60 du gène de la dystrophine). Lors de leur dernière tentative, 3 embryons surnuméraires avaient été congelés au deuxième jour post fécondation.

Le couple C2 présentait un risque de transmission de la myopathie de Duchenne (patiente porteuse du même haplotype que son frère atteint, mais sans délétion mise en évidence). Le conjoint de cette patiente présentait une azoospermie liée à un syndrome de Klinefelter. Une FIV conventionnelle avait été pratiquée avec sperme de donneur. Une grossesse a été obtenue après cette première tentative. Le diagnostic prénatal a montré un foetus atteint ce qui a entraîné une interruption médicale de grossesse. Quatre embryons avaient été congelés au troisième jour post fécondation.

Le couple C3 avait été adressé pour un DPI en raison de la présence d'une translocation Robertsonienne chez la patiente dont le caryotype était 45,XX,der(13 ;22)(q10;q10). Six tentatives d'inséminations intra-utérines et une FIV conventionnelle avaient été effectuées se soldant par trois fausses couches précoces. Lors de cette première tentative de FIV, 5 embryons ont été congelés à J2, un cycle de décongélation de 2 embryons avait déjà été effectué sans succès.

Méthodes

Les biopsies étant pratiquées à J3 les embryons ont donc été décongelés (kit de décongélation embryonnaire, Médi-Cult, Lyon) la veille et gardé en culture jusqu'à J3 pour les couples C1 et C3.

Pour le couple C2, les embryons on été décongelés le jour même de la biopsie. Les biopsies embryonnaires ont été réalisées à J3, un ou deux blastomères ont été prélevés par aspiration dans une micropipette de 35 mm de diamètre interne (CooK IVF, Brisbane, Australie). Un orifice a été pratiqué dans la zone pellucide à l'aide d'un faisceau laser (Laser Fertilase, Société MTG, Altdorf, Allemagne). Après biopsie, l'embryon a été replacé dans un milieu de culture (G2.2 Vitrolife, JCD, Lyon) jusqu'au moment du transfert. Pour le couple C1, une PCR (Polymerase Chain Reaction) multiplexe [2] a été réalisée, la cellule a été placée dans un tube contenant un tampon de lyse permettant d'extraire l'ADN. Pour les couples C2 et C3, le diagnostic utilisait l'hybridation in situ avec sondes d'ADN fluorescentes ou FISH. La cellule a été placée sur une lame de verre dans une goutte d'HCL/Tween20 [3] permettant la digestion du cytoplasme de la cellule. La technique de FISH est utilisée pour les indications chromosomiques et pour le diagnostic de sexe. Les sondes d'ADN utilisées sont spécifiques des régions chromosomiques impliquées dans le remaniement ou spécifiques des chromosomes X et Y (dans certaines maladies liées à l'X non caractérisées sur le plan moléculaire ce qui était le cas pour le couple C2).

Préparation de la muqueuse utérine

Pour ces trois couples dont le DPI a été réalisé à partir d'embryons congelés aux deuxième ou troisième jours, la préparation endométriale a fait appel à l'association Estima G (Laboratoire EFFIK, Paris), 200 mg/24 h associée à de l'Utrogestan (Laboratoires Besins-Iscovesco, Paris), 600 mg/24 h à partir du 14e jour du cycle. Les transferts embryonnaires (cathéter simple de Frydman, Laboratoire CCD, Paris) ont eu lieu pour le couple C1 et C3 le quatrième jour et pour le couple C2 le troisième jour.

Résultats

Le résultat de l'analyse génétique a été rendu le jour même ou le lendemain de la biopsie.

Au total, trois couples ont bénéficié d'un DPI sur embryons congelés et décongelés (tableau I). Dix embryons ont été décongelés. Huit ont résisté au cycle congélation/décongélation. Ces huit embryons ont été biopsiés. Cinq embryons non atteints ont pu être transférés au cours de trois cycles de transfert. Pour le couple C1, les trois embryons analysés étaient non atteints. Pour le couple C2, un embryon était de sexe gonosomique XX et un embryon était XY. Pour le couple C3, un embryon était équilibré pour les chromosomes 13 et 22, et deux embryons étaient porteurs d'un déséquilibre chromosomique.

Deux dosages de ßhCG ont été positifs et deux grossesses cliniques (sac embryonnaire visualisé à l'échographie) ont été obtenus. Une fausse couche spontanée est survenue à 6 semaines d'aménorrhée (SA) pour le couple C2 sans possibilité d'analyse du produit de fausse couche.

Pour le couple C1, étant donné qu'il avait été transféré 2 embryons XX et un embryon XY (non porteur de la délétion de l'exon 60 du gène de la dystrophine), la vérification du DPI par un DPN se posait. Une prise de sang maternel a alors été réalisée à 10 SA afin d'y rechercher de l'ADN foetal [4] (amplification de la séquence SRY). Le sexe foetal étant féminin, un simple contrôle échographique a pu donc être pratiqué évitant ainsi un prélèvement invasif pour un contrôle moléculaire. Une petite fille est née au terme de 40 SA, par voie basse, pesant 3 640 g mesurant 52 cm et dont le périmètre crânien était de 36 cm, l'Apgar était de 9. Aucune malformation n'a été observée à la naissance.

Discussion

Nous rapportons la prise en charge de trois couples par DPI pratiqué sur embryons congelés et décongelés et la première naissance en France d'un enfant issu d'embryons congelés, décongelés et biopsiés. Lorsque pour la première fois nous avons été sollicités pour la pratique d'un DPI sur embryons congelés, se posait la question de la faisabilité de la biopsie embryonnaire d'une part et de l'analyse génétique pratiquée sur noyau congelé et décongelé d'autre part.

Les données sur modèle murin étaient rassurantes en terme de faisabilité puisque des embryons de 6 à 8 cellules congelés/décongelés avaient été biopsiés sans dommage avec des taux de survie et de développement embryonnaire comparables à ceux obtenus avec des embryons non biopsiés [5].

Du fait d'un durcissement de la zone pellucide comme cela a été décrit dans l'éclosion embryonnaire assistée post décongélation, le temps mis pour rompre la zone pellucide aurait pu être allongé [6]. Nous n'avons pas rencontré ce problème dans la pratique de ces DPI où la technique de perforation utilisait un faisceau laser.

Le DPI avait également déjà été appliqué sur des embryons décongelés par l'équipe de Magli et al.[7] où 3 grossesses cliniques ont été obtenues pour 16 cycles de transfert avec 40 embryons transférés (taux d'implantation de 10 %). Ces données rassurantes sur l'innocuité de la biopsie et le succès technique du diagnostic, nous ont permis d'envisager la possibilité d'effectuer ces DPI.

Dans le cadre du DPI, ce n'est qu'après la biopsie embryonnaire, que se pose la question de la congélation si un excès d'embryons indemnes a été obtenu. Un nombre important d'embryons sont congelés au décours des cycles DPI comme le rapporte le Consortium Européen [8] 490 embryons congelés sur 8 098 embryons biopsiés depuis 3 ans, sans détailler les résultats post décongélation en terme de survie et de taux d'implantation.

Notre expérience reste faible pour le moment : sept embryons surnuméraires indemnes ont été décongelés, deux ont pu être transférés.

Ces données concernant la survie post-décongélation d'embryons biopsiés rejoignent l'expérience de Magli et al.[7] qui ont congelé 55 embryons ayant une bonne morphologie et ont constaté seulement 9 % d'embryons intacts : 19 (34 %) étaient soit lysés (n = 13), soit avaient une zone pellucide vide (n = 6). Parmi les 31 restants, le taux de survie exprimé en nombre de blastomères présents divisé par le nombre de blastomères au moment de la congélation a été de 38 % alors qu'il est habituellement de 61 % suggérant un effet délétère de la biopsie suivie d'une congélation. Une étude menée par Ciotti et al.[9] sur embryons humains anormaux confirme la faible survie des embryons congelés après biopsie et quelle que soit la technique d'ouverture utilisée par les auteurs, les chiffres sont catastrophiques lorsque en plus de la perforation de la zone pellucide, un blastomère a été retiré. Après ICSI la congélation embryonnaire chez l'homme donne des résultats satisfaisants [10] probablement en raison de la taille minime de la perforation créée par la pipette d'injection.

Devant les faibles résultats de la congélation post biopsie et les résultats acceptables de la biopsie post congélation, certaines situations cliniques posent un dilemme. En effet, la population féminine du DPI étant habituellement jeune et fertile l'obtention d'une réponse ovarienne assez forte est fréquente. Dans ce cas, faut-il congeler une partie des embryons avant un DPI ou pratiquer la biopsie de tous les embryons et congeler les embryons surnuméraires sains ? De la même façon, dans les circonstances où un transfert embryonnaire doit être évité (syndrome d'hyper stimulation, progestérone élevée ou muqueuse utérine fine) cette question peut également être posée. De cette difficulté technique, pourrait résulter une augmentation du nombre d'embryons frais transférés et par conséquent une augmentation du risque de grossesses multiples.

Tout récemment, certaines équipes [11],[12] ont rapporté une amélioration du taux de survie des blastomères, en doublant la concentration de sucrose dans le milieu de congélation. Pour la première équipe [11], le taux de survie des blastomères obtenu a été de 64,2 % versus 46 % et pour la deuxième [12] de 80,1 % versus 50,5 %. Ces résultats encourageants pourraient s'ils sont confirmés dans notre laboratoire, permettre une congélation plus efficace des embryons biopsiés. Ainsi, une diminution du nombre d'embryons transférés frais serait envisageable limitant le risque de grossesses multiples.

Nous avons donc pu montré que le diagnostic génétique pré-implantatoire était applicable sur embryons congelés puis décongelés. Il nous paraît donc licite de proposer un DPI aux couples présentant un risque de transmission d'une maladie génétique et ayant des embryons congelés.

Remerciements

Ils vont à l'ensemble des techniciennes de laboratoires, médecins, sages-femmes, infirmières, secrétaires, qui constituent les équipes de la F.A.M.A Necker-Béclère et sans qui ces DPI n'auraient pu être réalisés.

Références

[1] Handyside A, Lesko J, Tarin J, Winston R, Hugues M. Birth of a normal girl after in vitro fertilization and preimplantation diagnostic testing for cystic fibrosis. N Engl J Med 1992; 327: 905-9.

[2] Ray PF, Vekemans M, Munnich A. Single cell multiplex PCR amplification of five dystrophin gene exons combined with gender determination. Mol Hum Reprod 2001; 7: 489-94.

[3] Xu K, Huang T, Liu T, Shi Z, Rosenwaks Z. Improving the fixation method for preimplantation genetic diagnosis by fluorescent in situ hybridization. J Assist Reproduction Genet 1998; 9: 570-4.

[4] Tachdjian G, Frydman N, Audibert F, Ray PF, Kerbrat V, Ernault P, Frydman R, Costa JM. Clinical application of fetal sex determination in maternal blood in a preimplantation genetic diagnosis centre. Hum Reprod 2002; 17: 2183-6.

[5] Snabes MC, Cota J, Hughes MR. Cryopreserved mouse embryos can successfully survive biopsy and refreezing. J Assist Reproduction Genet 1993; 10: 513-6.

[6] Tucker MJ, Cohen J, Massey JB, Mayer MP, Wiker SR, Wright G. Partial dissection of zona pellucida of frozen-thawed human embryos may enhance blastocyst hatching, implantation, and pregnancy rates. Am J Obstet Gynecol 1991; 2: 341-5.

[7] Magli MC, Gianaroli L, Fortini D, Ferraretti AP, Munne S. Impact of blastomere biopsy and cryopreservation techniques on human embryo viability. Hum Reprod 1999; 14: 770-3.

[8] ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Consortium: data collection III. Hum Reprod 2002; 1: 233-46.

[9] Ciotti PM, Lagalla C, Ricco AS, Fabbri R, Forabosco A, Porcu E. Micromanipulation of cryopreserved embryos and cryopreservation of micromanipuled embryos in PGD. Mol cell Endocrinol 2000; 169: 63-7.

[10] Kowalik A, Palermo GD, Barmat L, Veeck L, Rimarachin J, Rosenwaks Z. Comparison of clinical outcome after cryopreservation of embryos obtained from intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization. Hum Reprod 1998; 13: 2848-51.

[11] Jericho H, Wilton L, Edgar DH. A modified method for cryopreservation of biopsied human preimplantation embryos. XIX ESHRE Vienne. Hum Reprod 2002; 17: O29.

[12] Stachecki J, Willadsen S, Cohen J, Munne S. High rate of survival after cryopreservation of biopsied human embryos. ASRM Seatttle. Fertil Steril 2002; 78 (suppl): S11.

Illustrations


© 2003 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
EM-CONSULTE.COM is registrered at the CNIL, déclaration n° 1286925.
As per the Law relating to information storage and personal integrity, you have the right to oppose (art 26 of that law), access (art 34 of that law) and rectify (art 36 of that law) your personal data. You may thus request that your data, should it be inaccurate, incomplete, unclear, outdated, not be used or stored, be corrected, clarified, updated or deleted.
Personal information regarding our website's visitors, including their identity, is confidential.
The owners of this website hereby guarantee to respect the legal confidentiality conditions, applicable in France, and not to disclose this data to third parties.
Close
Article Outline
You can move this window by clicking on the headline
@@#110903@@