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Journal de Gynécologie Obstétrique et Biologie de la Reproduction
Volume 44, n° 6
pages 485-495 (juin 2015)
Doi : 10.1016/j.jgyn.2015.02.015
Received : 31 October 2014 ;  accepted : 27 February 2015
La vitrification : principes et résultats
Vitrification: Principles and results
 

J.F. Griveau a, , M. Lopes b, G. Jouve a, S. Veau a, C. Ravel a, K. Morcel c
a Service de biologie de la reproduction-CECOS, CHU de Rennes, 16, boulevard de Bulgarie, 35033 Rennes, France 
b Polyclinique de l’Atlantique, centre de procréation médicalement assistée, 44819 Saint-Herblain, France 
c Unité de médecine de la reproduction, CHU de Rennes, 35033 Rennes, France 

Auteur correspondant.
Résumé

La congélation du sperme et des embryons est une technique de routine appliquée avec succès depuis de nombreuses années. La vitrification récemment autorisée en France tend à remplacer progressivement la technique conventionnelle de congélation lente, bouleversant ainsi les pratiques dans la prise en charge des patients. Elle permet désormais la cryoconservation des ovocytes, jusque-là extrêmement difficile du fait des caractéristiques particulières propres à cette cellule, et ouvre de nouvelles perspectives notamment en don d’ovocytes ou bien encore en préservation de la fertilité. Cette revue de la bibliographie s’est donc attachée à examiner l’apport de cette technique dans la congélation des ovocytes et des embryons humains à différents stades de développement. Si à l’évidence, la vitrification apparaît comme la méthode de choix actuelle pour la cryoconservation des ovocytes ainsi que des blastocystes, les résultats sont moins tranchés en ce qui concerne les embryons à stades précoces. Quant au devenir des enfants, les publications les plus récentes ne montrent aucun impact négatif de cette technique sur les taux de malformation des nouveau-nés.

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Summary

Sperm and embryos cryopreservation is a commonly applied technique for several years. Recently authorized in France, vitrification tends to replace gradually the conventional technique of slow freezing, so upsetting the practices in the management of patients. It allows from now on the cryopreservation of oocytes and opens new perspectives in egg donation either still in fertility preservation. This review thus attempted to examine the contribution of vitrification in the freezing of oocytes and human embryos at various stages of development. If obviously vitrification appears as the current method of choice for the cryopreservation of oocytes as well as blastocystes, the results are less cut as regards embryos to early stages. No increase in adverse obstetric and perinatal outcomes in children conceived from vitrified oocytes or embryos is noted in the literature.

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Mots clés : Vitrification, Embryons, Ovocytes, Préservation de fertilité

Keywords : Vitrification, Embryos, Oocytes, Fertility preservation


Introduction

La cryoconservation est d’une importance cruciale en biologie de la reproduction. Depuis le milieu des années 1980 et la première naissance d’un enfant issu d’un embryon congelé, la congélation et le stockage des embryons se sont largement développés afin d’optimiser les cycles de fécondation in vitro en évitant le transfert simultané de plusieurs embryons et les risques obstétricaux liés aux grossesses multiples qui en sont le corollaire.

Le développement conjoint de la culture embryonnaire jusqu’au stade de blastocyste et la nécessité croissante de pouvoir cryoconserver des ovocytes afin de préserver la fertilité de jeunes femmes devant subir un traitement stérilisant ou afin de faciliter la gestion du don d’ovocytes ont conduit à l’émergence de protocoles plus particulièrement adaptés à ces types cellulaires. C’est dans ce contexte que la vitrification s’est rapidement imposée au détriment de l’approche traditionnelle de congélation par refroidissement lent. Rapportée pour la première fois il y a plus de 25ans par Rall et Fahy [1], elle n’a été officiellement autorisée en France que par la loi du 7 juillet 2011, qui, si elle mentionne spécifiquement la vitrification ovocytaire, ne précise rien sur la vitrification embryonnaire qui avait de fait été actée un an auparavant par l’Agence de biomédecine.

Principes et contraintes de la vitrification
Principe

La formation de cristaux de glace dans le compartiment intracellulaire est considérée comme la première cause de mortalité cellulaire lors d’une cryopréservation. Le cristal de glace génère en effet des lésions membranaires et entraîne la destruction des structures de la cellule.

La vitrification est la solidification d’une solution par une élévation extrême de la viscosité à basse température sans formation de cristaux de glace. Ce processus est obtenu par une combinaison de concentrations élevées de cryoprotecteurs associées à des vitesses de refroidissement ultrarapides. En effet, dans les conditions autorisant la vitrification d’une solution, il existe un ralentissement des mouvements translationnels des molécules empêchant le réarrangement moléculaire ordonné en cristal de glace, comme observé lors de la congélation lente.

Trois principaux facteurs doivent être considérés et permettent une vitrification optimale.

La vitesse de refroidissement

La vitesse de refroidissement obtenue par plongée des cellules dans l’azote liquide (−196°C) : celle-ci atteint plusieurs milliers de degrés Celsius par minute et dépend du volume, du contenant, de la conductivité thermique ou bien encore de la composition de la solution [2]. Il est possible d’augmenter encore cette vitesse en utilisant de l’azote liquide refroidi à son point de cristallisation (−210°C) par l’application d’une pression négative [3].

La viscosité du milieu

Elle est définie par la concentration et le type des différents cryoprotecteurs utilisés durant la vitrification. Plus la concentration en cryoprotecteurs est élevée, plus la température de transition vitreuse est élevée, plus la probabilité de nucléation et de cristallisation est faible. Les cryoprotecteurs utilisés diffèrent par leur toxicité, leur taux de pénétration et leur température de transition vitreuse. Une combinaison de différents cryoprotecteurs est souvent utilisée pour augmenter la viscosité du milieu, élever la température de transition vitreuse et réduire le niveau de toxicité.

Le volume de la solution

Plus celui-ci est faible, plus la probabilité de vitrification est élevée [2, 3]. Les petits volumes facilitent les échanges thermiques et permettent d’accroître les vitesses de refroidissement et de réchauffement.

Ces 3 facteurs combinés permettent de prédire la probabilité de vitrification selon l’équation suivante [4] :
Probabilité   de   vitrification=Vitesse   de   refroidissement×Viscosité/Volume

Les cryoprotecteurs

Il existe deux types de cryoprotecteurs : les cryoprotecteurs pénétrants (ou diffusibles) et les cryoprotecteurs non pénétrants (ou non diffusibles). Ils sont caractérisés par une viscosité élevée et une forte hydrophilie. Ils permettent de diminuer la température de formation de la glace et d’augmenter la température de transition vitreuse à mesure que leur concentration augmente. Outre leur capacité de pénétration, ils diffèrent par leurs propriétés thermiques et leur toxicité cellulaire.

Les cryoprotecteurs pénétrants

Ce sont des solvants organiques de faible poids moléculaire, pour la plupart des dérivés d’alcools. Ils ont la capacité de traverser facilement les membranes cellulaires, et limitent ainsi la formation de cristaux de glace intracellulaires, la déshydratation et la formation de glace extracellulaire en maintenant un équilibre osmotique.

Parmi ceux-ci se trouvent : l’éthylène glycol (EG), le propanediol (PROH), le glycérol et le diméthyl sulfoxyde (DMSO). L’EG est un dialcool organique très miscible avec l’eau et sa vitesse de pénétration est très rapide. Le DMSO est un solvant des corps gras qui interagit avec l’eau et abaisse le point de congélation ; sa vitesse de pénétration est moins rapide que celle de l’EG. Il a été le premier cryoprotecteur à avoir été utilisé en congélation lente [5, 6] mais plusieurs études ont rapidement observé une toxicité importante sur les embryons humains de celui-ci par rapport au PROH [7, 8] qui l’a rapidement supplanté. Cependant, concernant la vitrification, l’étude de Kartberg et al. en 2008 [9] a montré que les solutions de vitrification avec DMSO protégeaient mieux l’intégrité membranaire que celles sans DMSO.

Les fortes concentrations de cryoprotecteurs pénétrants étant toxiques pour les cellules, leur exposition doit donc être limitée dans le temps afin de diminuer leur effet délétère potentiel sur la structure et les fonctions cellulaires [10]. L’utilisation de mélanges de cryprotecteurs permet également de réduire les concentrations de chacun d’entre eux, et l’association DMSO/EG est maintenant largement répandue et sans doute la plus utilisée tout du moins en ce qui concerne la vitrification ovocytaire.

Les cryoprotecteurs non pénétrants

Ils peuvent être de 2 types : de haut poids moléculaire (polymères) et de faible poids moléculaire (sucres). Leur fort pouvoir osmotique entraîne une déshydratation intracellulaire et renforce lors du refroidissement l’effet de prévention des cristaux. Les sucres protègent également la membrane cellulaire par leur interaction avec elle. Ils permettent de limiter la concentration intracellulaire du cryoprotecteur pénétrant et sa toxicité éventuelle [11, 12].

Au cours de la décongélation, ils préviennent le choc osmotique en maintenant l’osmolarité extracellulaire.

Les polymères sont le polyéthylène glycol, le dextran ou la polyvinylpyrrolidone. Les sucres sont le lactose, le galactose, le tréhalose et le saccharose (ou sucrose). Actuellement, ces différentes molécules sont utilisées la plupart du temps en association (cryoprotecteur pénétrant et non pénétrant).

Techniques de vitrification
Dispositifs

Différentes techniques ont été développées avec le but commun de réduire le volume de solution contenant les ovocytes à vitrifier, afin d’augmenter drastiquement les transferts de température durant le refroidissement et le réchauffement. Ainsi une multitude de méthodes ont été décrites dans la littérature ces dix dernières années.

Les différentes techniques décrites peuvent être séparées en deux grandes catégories : les techniques ouvertes et les techniques fermées.

Les systèmes ouverts incluent : grille de microscopie électronique, Minimum Drop Size (MDS), Cryotop, Cryoloop, Hemi-Straw, Cryoleaf, Open Pulled Straw (OPS), superfine OPS…

Parmi les systèmes fermés se trouvent : Closed Pulled Straw (CSP), Cryotip, High-Security Vitrification Device (HSV), Sealed Pulled Straw, Rapid-i™…

Chacune des deux catégories présente des avantages spécifiques. Dans les systèmes ouverts, lorsque la taille de la goutte de solution à vitrifier est contrôlée (≈0,1μL), des vitesses de refroidissement importantes sont atteintes, de l’ordre de 20 000°C/min. En effet, l’échantillon à vitrifier est directement au contact de l’azote liquide. Les vitesses de réchauffement sont également élevées et obtenues par contact direct avec la « solution de réchauffement » (warming solution ). Ces techniques permettent de maintenir l’état vitreux malgré l’utilisation de faibles concentrations intracellulaires en cryoprotecteurs, secondaires à des durées d’exposition courtes. Les systèmes fermés présentent l’avantage de rendre ces méthodes plus sûres tout en obtenant des vitesses de refroidissement qui restent élevées. Cependant, et compte tenu du rapport surface/volume qui augmente graduellement des stades « ovocytes » à « blastocystes » et qui est corrélé de manière positive à la pénétration des cryoprotecteurs, les systèmes ouverts sont en principe mieux indiqués dans le cas de la congélation ovocytaire bien qu’elle soit tout à fait réalisable en système fermé.

Inconvénients des systèmes ouverts

Le principal inconvénient des systèmes ouverts est la mise de l’échantillon au contact direct de l’azote liquide, ce qui peut être source de contaminations, aussi bien lors de la vitrification que durant le stockage. Durant la vitrification, ces contaminations peuvent survenir du fait d’un contact direct avec de l’azote liquide non stérile et chimiquement impur, ou durant le stockage, lors de transmissions croisées avec des échantillons imparfaitement protégés.

La possibilité de contaminations lors de ces processus reste néanmoins controversée. Dans des conditions expérimentales, des contaminations croisées entre des cellules reproductrices congelées ont été rapportées [13]. Cependant, une revue récente a considéré que les contaminations croisées avec les systèmes ouverts sont négligeables, sous réserve de manipulations dans des conditions stériles, requises dans les laboratoires de biologie de la reproduction [14]. De fait, aucune contamination n’a été rapportée à ce jour dans des conditions normales de fonctionnement.

Pour remédier à ce problème, des méthodes ont été développées pour prévenir toute contamination potentielle. La stérilisation par rayonnement ultra-violet de petites quantités d’azote liquide pendant la vitrification a été décrite et semble satisfaisante [15], tandis que le stockage en vapeur d’azote a été également rapporté [16, 17]. Cependant, la nécessité d’une température stable en vapeur d’azote et le surcoût lié à l’utilisation d’azote liquide stérile ont été des arguments supplémentaires pour favoriser l’emploi des systèmes fermés. De plus, des directives européennes stipulent la nécessité de garantir l’asepsie du matériel biologique au cours du refroidissement et du stockage (directive européenne du 31 mars 2004 et de sa mise à jour du 8 février 2006, définissant les exigences du Conseil de l’Union européenne en matière de qualité et de sécurité pour la conservation et le stockage des cellules humaines).

Développement des systèmes fermés

Récemment, des systèmes clos sont apparus afin de s’affranchir du risque potentiel de contamination qui perdure avec l’utilisation des systèmes ouverts. Le principal inconvénient de ces systèmes fermés réside dans la diminution de la vitesse de refroidissement, qui passe de 20 000°C/min à moins de 2000°C/min. Plusieurs systèmes fermés sont actuellement disponibles dont le kit-Vitrification Haute Sécurité (HSV) de Cryo Bio System et le Rapid-i™ de Vitrolife®

Le HSV est basé sur le même concept que la demi-gouttière ouverte (Hemi-Straw), à l’extrémité de laquelle les cellules sont déposées dans un minimum de solution cryoprotectrice, avant d’être insérée dans une paillette haute sécurité de 0,3mL (CBS, France) qui sera thermosoudée aux deux extrémités. La paillette est ensuite plongée dans l’azote liquide. La vitesse moyenne de refroidissement est de 1300°C/min et celle de réchauffement de 3000°C/min [18, 19].

Le concept initial du Rapid-i™ est basé sur le même principe que le Cryoloop (système ouvert) : les ovocytes sont déposés dans un trou à l’extrémité du Rapid-i™, et le volume de solution cryoprotectrice contenant les ovocytes est calibré et réduit : 50nL. Le support est ensuite inséré dans la paillette Rapid-Straw préalablement refroidie dans l’azote liquide, qui va être hermétiquement soudée par ultrasons. La vitesse moyenne de refroidissement avec ce système est estimée à 1220°C/min et celle de réchauffement à 7700°C/min.

Résultats de la vitrification
Zygotes

La littérature assez peu abondante concernant la congélation des zygotes reflète sans doute le faible intérêt que les centres portent à cette pratique. Les premières publications rapportant des résultats après vitrification de zygotes datent de 2002. Dans une étude portant sur 56 zygotes et utilisant l’éthylène glycol et le sucrose comme cryoprotecteurs, Isachenko et al. [20] rapportent des taux de survie de 71,1 % et 4 grossesses sur 26 embryons obtenus. Utilisant le Cryotop et une association DMSO/éthylène glycol/sucrose, Al-Hasani et al. en 2007 [21] rapportent sur 339 zygotes un taux de survie de 89 %. Sur les 302 zygotes restants, 243 embryons ont été obtenus et transférés. Le taux d’implantation était de 15,6 % et le taux de grossesse de 36,9 %. Toujours en 2007, Griesinger et al. [22] publient une étude rapportant leurs résultats sur les cycles de FIV/ICSI où tous les zygotes ont été vitrifiés pour cause d’hyperstimulation. Ils rapportent un taux de survie de 77,8 % et un taux de grossesse de 29,2 % sur les cycles de réchauffement ultérieurs.

Sur une grande série de 5881 zygotes vitrifiés et 1944 zygotes congelés de manière classique, Kuwayama et al. en 2005 [23] semblent montrer la supériorité de la vitrification. Dans cette étude, les taux de survie, de clivage et de blastulation étaient plus élevés pour les zygotes vitrifiés (100, 93 et 56 %, respectivement) que pour la congélation lente (89, 90 et 51 %, respectivement).

Bien qu’il y ait quelques publications supportant le fait que les taux de grossesse et d’implantation des zygotes congelés de manière lente soient équivalents à ceux obtenus après transfert frais [24, 25], il existe des doutes quant au bon développement embryonnaire ultérieur [26]. Sur la balance, la vitrification semble être la meilleure technique de congélation des zygotes bien qu’à notre connaissance aucune étude prospective randomisée n’ait été publiée.

Embryons à j2–j3

Bien que la congélation lente ait été largement adoptée avec succès depuis les années 1980 et la première naissance rapportée par Trounson et Mohr en 1983 [27], Mukaida et al. publient dès 1998 [28] les premiers résultats obtenus après vitrification d’embryons dans un milieu à base d’éthylène glycol. Sur 52 embryons vitrifiés à j2 ou j3, ils rapportent un taux de survie de 79 % avec au moins 50 % de blastomères intacts et un taux d’implantation de 14 %. Dans une plus large série sur plus de 1500 embryons vitrifiés à l’aide de DMSO, Hsieh et al. rapportent en 1999 [29] un taux de survie de seulement 62,5 % et un taux d’implantation de 11,4 %. Ces premiers résultats un peu décevants avaient semblé sonner le glas de la vitrification des embryons par rapport à la congélation lente bien établie.

La publication en 2005 par Rama-Raju et al. [30] de taux de survie de plus de 95 % après vitrification d’embryons à j3 a relancé l’intérêt pour la vitrification des embryons à un stade précoce. Sur une série de plus de 900 embryons, la même équipe a rapporté en 2009 un taux de survie après vitrification de plus de 90 % avec un taux d’implantation de 18,1 % comparable à celui des embryons frais (23,5 %). Récemment, Cobo et al. [31] rapportent des taux de survie de plus de 94 % et des taux d’implantation de 34,6 % sur près de 3500 embryons vitrifiés à j3 en système ouvert dans une solution éthylène glycol/DMSO/sucrose.

Comparant la vitrification utilisant une combinaison DMSO/sucrose à la congélation lente, Mauri et al. en 2001 [32] rapportent des taux de survie et d’implantation plus élevés alors que Vutyavanich et al. [33], bien que rapportant également des taux de survie plus élevés, ne montrent pas de différence dans les taux d’implantation.

Dans une combinaison éthylène glycol/DMSO/sucrose, Kuwayama et al. [23] rapportent en 2005 une augmentation significative des taux de survie (98 % versus 91 %) mais pas des taux de grossesse par rapport à la congélation lente. Dans une étude comparative similaire en 2010, Wilding et al. [34] ne rapportent aucune différence entre les deux méthodes de congélation.

Dans une étude randomisée contrôlée, Balaban et al. [35] utilisant une solution propylène glycol/éthylène glycol/sucrose rapportent un meilleur taux de survie (94,8 % versus 88,7 %) ainsi qu’un taux plus élevé d’embryons intacts (73,9 % versus 45,7 %) après vitrification qu’après congélation lente d’embryons à j3 déshydratés dans du propandiol/sucrose.

Concernant le suivi des enfants nés après transfert d’embryons vitrifiés, une étude préliminaire publiée en 2009 par Rama-Raju et al. [36] sur 69 naissances ne montrait aucune différence tant au niveau de l’Apgar, 9,4 après 10minutes, que du taux de malformations congénitales, 1,18 %, comparés à ceux observés après transfert d’embryons frais (9,6 et 2,78 %, respectivement). Résultats confirmés par l’équipe de Shih et al. en 2012 [37] sur près de 500 enfants où là encore aucune différence entre les naissances issues de transferts frais ou vitrifiés n’a été observée tant au niveau des poids de naissance (3216g versus 3337g) que de l’Apgar à 10minutes (9,92 versus 9,89) ou des malformations (0,62 % versus 1,42 %).

Il apparaît donc clairement au travers de toutes ces études que la vitrification des embryons à un stade précoce permet d’obtenir des taux de survie en général de plus de 90 %. Mais si dans certaines études comparatives la vitrification semble surpasser la congélation lente, dans d’autres, y compris dans celles rapportant de très hauts taux de survie, la vitrification et la congélation lente donnent des résultats très similaires en termes d’implantation. Ainsi, il n’y a pas d’évidence claire en faveur de l’une ou de l’autre méthode de congélation en ce qui concerne le stade d’embryons clivés à j2–j3.

Blastocystes

La première naissance après transfert de blastocyste vitrifié a été rapportée par Yokota et al. en 2001 [38] après utilisation d’éthylène glycol et de DMSO comme cryoprotecteurs. Cette approche a depuis été largement adoptée avec des systèmes qui permettent un refroidissement ultrarapide dans de très petits volumes de cryoprotecteurs. En 2003, Mukaida et al. [39] publient sur une série de 569 blastocystes un taux de survie de 87 % et un taux d’implantation de 21 %, taux qu’ils améliorent sur une seconde série de 502 blastocystes en induisant une contraction du blastocèle par une micro-aiguille ou un laser avant la vitrification (respectivement 97 et 47 %).

Utilisant un système fermé, Ebner et al. [40] rapportent des taux de survie et d’implantation de respectivement 74 et 39 % de même que Vanderzwalmen et al. [19] qui toujours à l’aide d’un système fermé obtiennent un taux de survie de 86 % et un taux d’implantation de 30 %. Toutes les études récentes basées sur de grandes séries de blastocystes rapportent des taux de survies de plus de 90 % [41, 42] aussi bien en système ouvert qu’en système fermé. Alors que dans l’étude de Liebermann, le taux d’implantation global était de 29,4 %, dans celle de Goto et al., il était fortement lié à l’âge de la patiente et atteignait 67 % chez les femmes âgées de 22 à 33ans. Plus récemment, une étude de Cobo et al. [31] portant sur plus de 2000 blastocystes rapporte un taux de survie de plus de 96 % ainsi qu’un taux d’implantation de 40,2 %.

Une méthode alternative utilisant de très hautes concentrations d’éthylène glycol (40 %) a été rapportée par Cho et al. en 2002 [43] avec des taux de survie de 84 % et des taux d’implantation de 21 %, taux qui sont là encore améliorés après contraction artificielle du blastocèle [44]. Remplaçant le DMSO par du glycérol mais toujours en association avec de l’éthylène glycol, Stachecki et al. [45] rapportent un taux de survie de 81,4 % avec un taux d’implantation de 40 %.

Dans les études comparant les transferts de blastocystes frais versus vitrifiés, des taux d’implantation équivalents [46] ou même supérieurs [47] sont rapportés. Dans la plus large étude, celle de Takahashi portant sur plus de 400 blastocystes vitrifiés, les taux d’implantation étaient en effet de 29 % contre 23,4 % pour les blastocystes frais. Une étude rapporte tout de même un taux d’implantation inférieur pour les blastocystes vitrifiés mais un taux de naissances vivantes équivalent [48]. En ce qui concerne les blastocystes vitrifiés avec une zone pellucide ouverte, Zech et al. [49] rapportent également un taux d’implantation comparable à celui des blastocystes frais (26 % versus 25 %). De même, Van Landuyt et al. en 2011 [50] utilisant un système de vitrification fermé rapportent des taux d’implantation comparables après transfert de blastocystes vitrifiés ou frais.

Dans une étude comparant la vitrification et la congélation lente de blastocystes, Stehlik et al. [51] rapportent une augmentation des taux de survie (100 % versus 83,1 %) et des taux d’implantation (19,4 % versus 7,4 %). Des taux de grossesse significativement plus élevés ont été également associés à la vitrification (50,4 %) par rapport à la congélation lente (25,9 %) dans une étude rétrospective portant sur 189 blastocystes congelés lentement et 58 blastocystes vitrifiés [52]. Si Kuwayama et al. en 2005 [23] rapportent bien une légère mais significative augmentation des taux de survie après vitrification (90 %) comparée à la congélation lente (84 %), aucune différence ni dans les taux de grossesse (53 % versus 51 %) ni dans les taux d’accouchement (45 % versus 41 %) n’a été observée. De même, dans une étude portant sur plus de 500 blastocystes dans chaque groupe, Liebermann et Tucker [53] ne rapportent aucune différence significative aussi bien dans les taux de grossesses (46,1 % versus 42,9 %) que dans les taux d’implantation (30,6 % versus 28,9 %) entre les deux méthodes de congélation.

Concernant le suivi des enfants, les publications les plus importantes et les plus récentes ne font état d’aucune différence entre les issues de grossesses des blastocystes frais ou vitrifiés. Dans une étude portant sur plus de 6600 enfants mais prenant en compte aussi bien des transferts à j3 que des transferts au stade blastocyste, Kato et al. [54] rapportent même une augmentation significative du poids de naissance moyen, 3028g versus 2943g chez les enfants issus d’un transfert d’un embryon/blastocyste vitrifié par rapport à ceux issus d’un transfert frais. Dans leur étude, le taux de malformations à la naissance (2,4 % versus 1,9 %) ainsi que le taux de mortalité périnatale (0,6 % versus 0,5 %) étaient comparables entre les transferts vitrifiés et frais.

Plus récemment, l’étude de Roy et al. [55] portant sur 1157 naissances après transfert de blastocystes frais et 645 après transfert de blastocystes vitrifiés est venue confirmer une augmentation significative non seulement des poids de naissance après transfert de blastocystes vitrifiés (3441g versus 3296g) par rapport aux transferts frais, mais également de l’âge gestationnel (39,3 semaines versus 39 semaines).

Bien que certaines études rapportent d’excellent taux de survie et de grossesse après congélation lente, la vitrification semble maintenant apparaître comme la méthode de choix pour la cryoconservation de blastocystes. Les résultats sont moins tranchés en ce qui concerne l’utilité ou non d’induire une contraction artificielle du blastocèle. À l’instar de la vitrification embryonnaire, les dernières études concernant le suivi des enfants ne montrent aucun impact négatif de cette technique sur leur état de santé à la naissance [31, 55].

Ovocytes : intérêts, difficultés et résultats

Les applications cliniques de la congélation ovocytaire sont très importantes et incluent majoritairement la préservation de la fertilité ainsi que le don d’ovocytes et dans une moindre mesure les syndromes d’hyperstimulation, l’accumulation d’ovocytes chez les patientes « mauvaises répondeuses », ou bien encore, lorsqu’elle est autorisée, la préservation de la fertilité pour raison sociale. L’inefficacité des techniques de congélation disponibles jusqu’à maintenant du fait des caractéristiques mêmes de l’ovocyte avait fortement limité la mise en œuvre de ces applications dans la pratique clinique.

Intérêt en don d’ovocytes

Le don d’ovocytes est une technique d’AMP bien établie, dont les indications actuelles sont principalement les maladies génétiques transmises par la mère et l’insuffisance ovarienne prématurée.

Deux facteurs sont déterminants dans la prise en charge en don d’ovocytes : d’une part, le transfert d’embryons de bonne qualité et, d’autre part, une préparation endométriale optimale. Il est en effet important que le transfert embryonnaire ait bien lieu pendant la fenêtre d’implantation qui est propre à chaque receveuse. L’utilisation d’ovocytes « frais » nécessite donc la synchronisation de la receveuse avec le cycle de stimulation de la donneuse. Cette synchronisation contraignante pour la receveuse a un retentissement non négligeable sur sa vie personnelle et professionnelle. De plus, du fait de la pénurie de donneuses, plusieurs receveuses sont généralement synchronisées avec chaque donneuse, ce qui accroît encore les difficultés liées à leur programmation. La mise en place de la technique de vitrification et des premières banques d’ovocytes par les équipes espagnoles et américaines [56] bouleverse la prise en charge des patientes en permettant une dissociation de la programmation de la donneuse et des receveuses puisque la dévitrification des ovocytes puis le transfert embryonnaire peut à présent être programmé sur le principe du transfert d’un embryon congelé. Outre le confort de prise en charge des receveuses, cela permet une meilleure gestion des listes d’attente ainsi qu’une optimisation du nombre d’ovocytes donnés à chaque receveuse.

Intérêt en oncofertilité

Chaque année, des milliers de jeunes filles et de femmes en âge de procréer présentent un cancer. Même si l’objectif premier reste la réduction de la mortalité liée au cancer, la qualité de vie de ces femmes doit aussi être prise en compte. En effet, les progrès dans le traitement ont permis une hausse des taux de survie et une augmentation de l’espérance de vie. Cependant, la fertilité de ces femmes guéries de leur cancer peut être altérée soit par le cancer lui-même, soit par les traitements potentiellement gonadotoxiques [57]. Elles ont un risque d’insuffisance ovarienne prématurée (IOP) liée à l’action ovariotoxique de la chimiothérapie et/ou de la radiothérapie [58]. De plus, même si la fonction ovarienne est maintenue après le traitement du cancer, il existe une accélération de l’apoptose folliculaire et donc un raccourcissement de la période fertile chez ces femmes [59]. La préservation de la fertilité devient donc un enjeu majeur (Plan cancer 2014–2019). Le choix d’une stratégie individualisée de préservation de la fertilité pris lors de réunions de concertations pluridisciplinaires devra tenir compte du type de cancer, des risques ovariotoxiques des traitements, de l’âge de la patiente et de sa réserve ovarienne préalable [60].

La vitrification ovocytaire est une des techniques de préservation de la fertilité, avec la cryoconservation de cortex ovarien, la vitrification d’embryons, l’ovariopexie (en cas d’irradiation pelvienne) et l’utilisation d’agonistes du GnRH pendant la chimiothérapie bien que son efficacité comme protecteur de la fonction ovarienne soit très controversée [61].

Comme la cryoconservation ovocytaire nécessite de réaliser au préalable une stimulation ovarienne contrôlée avec ponction folliculaire, elle ne pourra être envisagée que dans certaines situations.

Un des critères restrictifs à son utilisation est l’âge de la patiente. Elle ne peut être proposée chez la petite fille et l’adolescente pré-pubère. Il faut aussi considérer la nécessité de réaliser une ponction folliculaire par voie vaginale, ce qui peut être un frein dans le choix de cette technique chez la jeune adolescente vierge.

D’autre part, le risque d’un recueil insuffisant d’ovocytes augmente avec l’âge, auquel s’ajoute l’augmentation du taux d’aneuploïdie. La probabilité de grossesses après vitrification ovocytaire a été étudiée sur des séries de patientes ne présentant pas de cancer. Rienzi et al. [62] ont estimé que lorsque moins de 8 ovocytes matures étaient vitrifiés, le taux de naissances vivantes est fortement diminué après 38ans (12,6 % versus 27,5 %). Stoop et al. [63] ont montré que le taux de naissances vivantes par ovocyte mature diminuait avec l’âge (23–37ans : 4,47 % ; 38ans : 3,8 % ; 43ans : 0,78 %). Par extrapolation, le nombre d’ovocytes matures pour une naissance vivante devrait atteindre 22,53 dans le groupe [23–37 ans] par rapport à 55,5 dans le groupe [38–43 ans]. Il fixe ainsi la limite d’âge à 37ans pour proposer une préservation de la fertilité. Cette limite doit bien sûr être discutée au cas par cas, notamment en tenant compte de la réserve ovarienne de la patiente, évaluée par le taux d’AMH et le compte des follicules antraux.

La durée nécessaire à la stimulation ovarienne (minimum 10–12jours) impose que la chimiothérapie ne soit pas à instaurer en urgence. Même si l’idéal est de débuter classiquement la stimulation ovarienne en phase folliculaire précoce (j1–j3 du cycle), des schémas de stimulation ovarienne peuvent être proposés selon la période du cycle lors du début de stimulation (phase folliculaire tardive, phase lutéale) afin de limiter le délai avant le début de la chimiothérapie. En phase lutéale, ce protocole associera de manière concomitante un antagoniste du GnRH pour initier la lutélolyse et une FSH pour la stimulation folliculaire [64]. En phase folliculaire tardive, il sera précédé d’un déclenchement de l’ovulation quand le follicule dominant atteint 18mm de diamètre [65]. Dans ces études, le nombre d’ovocytes recueillis n’était pas significativement différent entre les différentes périodes du cycle.

Enfin, en cas de cancer du sein, la vitrification ovocytaire est une option recommandée [66]. Cette procédure pourra être proposée après la chirurgie et avant la chimiothérapie adjuvante. Cependant, il convient d’être prudent en raison du risque tumoral éventuel, lié à l’élévation transitoire de l’estradiolémie, en particulier en cas de cancer du sein RH+. L’utilisation d’un anti-aromatase (létrozole) ou d’un anti-estrogène (tamoxifène) pendant la stimulation ovarienne pour réduire ce risque ne peut se faire, en France, que dans le cadre de protocoles de recherche. L’hormonothérapie adjuvante pendant 5ans est une autre donnée dont il faut tenir compte car elle entraîne une mise en différé du projet de grossesse. Or la moyenne d’âge au diagnostic est de 33ans chez les femmes de moins de 40ans [67]. L’utilisation des ovocytes vitrifiés rentrant dans le cadre de la prise en charge générale de l’AMP par l’assurance maladie (pas de prise en charge au-delà du 43e anniversaire), la vitrification ovocytaire ne devrait être proposée que pour les femmes de moins de 38ans. À l’opposé, même si certains protocoles de chimiothérapie tels que le protocole FEC sur 6 cycles sont à faibles risques (<20 %) d’aménorrhée chimio-induites pour les femmes de moins de 30ans [68], il pourrait toutefois être proposé, de principe, une préservation de la fertilité par vitrification ovocytaire, technique qui ne grève pas les possibilités de fertilité naturelle.

Comparée aux autres techniques de préservation de la fertilité, elle offre aussi certains avantages. En France, jusqu’en juillet 2011, cette technique n’était pas autorisée et seule la cryoconservation de cortex ovarien ou d’embryons pouvait être proposée comme technique de préservation de la fertilité.

La cryoconservation de cortex ovarien n’est justifiée que si le risque gonadotoxique du traitement est très élevé, en raison de son action délétère sur la fertilité naturelle. Il en découlait que la préservation de la fertilité n’était pas proposée pour les traitements à faible risque d’IOP, comme le protocole ABVD dans le lymphome de Hodgkin [66]. Cependant, un risque faible ne veut pas dire nul. Avec la technique de vitrification ovocytaire, on s’affranchit du caractère délétère sur la fertilité naturelle. Elle peut alors être proposée plus facilement, si le délai avant le début de la chimiothérapie le permet, même en cas de faibles risques d’IOP. Par ailleurs, elle évite le risque de réintroduire des cellules malignes résiduelles comme cela peut être le cas lors de greffe de tissus ovariens, notamment en cas de leucémies [69].

La cryoconservation embryonnaire est une technique, comme la vitrification ovocytaire, qui implique une stimulation ovocytaire et une ponction folliculaire. Il s’agit d’une technique maîtrisée par tous les centres d’AMP, offrant de bonnes chances d’obtenir une naissance vivante. L’étude nationale française en 2011 retrouvait un taux de naissances vivantes de 27 % chez des femmes ayant eu un cancer [70]. Cette technique soulève toutefois des questions éthiques car il ne s’agit plus de préservation de la fertilité féminine mais de préservation de la fertilité du couple. Elle ne peut pas être proposée aux femmes célibataires. En cas de décès d’un des membres du couple ou en cas de séparation, le sort de ces embryons orphelins amène à un questionnement éthique et juridique. Une patiente devenue infertile après traitement de son cancer peut n’avoir que les embryons issus de la fécondation de ses ovocytes avec les spermatozoïdes de son ex-conjoint, comme préservation de sa fertilité.

Difficultés de la congélation ovocytaire

La cryoconservation ovocytaire est délicate de par les caractéristiques mêmes de la cellule à congeler. L’impact de la congélation et des cryoprotecteurs sur le métabolisme ovocytaire va conditionner le succès de la vitrification, permettant l’évolution ultérieure en zygote puis en embryon. Les critères d’évaluation expérimentale de l’intégrité ovocytaire sont la survie à la cryoconservation, les taux de fécondation et le développement embryonnaire précoce. L’absence de critère fiable pour définir aujourd’hui la qualité ovocytaire gêne l’évaluation du retentissement de la cryoconservation sur la fonction ovocytaire. L’aptitude à la fécondation et au développement précoce témoigne néanmoins de l’intégrité d’une machinerie cellulaire complexe. C’est principalement chez la souris qu’ont été décrites la plupart des altérations des structures ovocytaires provoquées par la congélation.

Stade nucléaire de l’ovocyte

L’ovocyte est le plus souvent congelé en métaphase II. À ce stade, il a repris sa méiose et les risques d’atteinte du fuseau sont importants. Les microtubules qui le constituent sont en effet extrêmement sensibles au froid et se dépolymérisent rapidement. Au-delà de 10minutes à une température inférieure à 25°C, cette dépolymérisation est irrémédiable [71, 72] et entraîne des anomalies de ségrégation chromosomique, conduisant à des aneuploïdies [73]. La vitrification pourrait être moins traumatique sur le fuseau méiotique que la congélation lente et aurait ainsi moins d’impact sur la physiologie ovocytaire [72]. Cependant et sauf à avoir des durées d’exposition courtes, certains cryoprotecteurs comme le DMSO peuvent aussi avoir des effets délétères sur le fuseau et induire des anomalies chromosomiques [74].

La taille importante de l’ovocyte à ce stade de métaphase II rend également la congélation délicate car elle entraîne une diminution du ratio surface/volume. Ceci rend les ovocytes plus sensibles au froid et hautement susceptibles de former des cristaux de glace intracellulaires [75, 76].

Composition du cytoplasme ovocytaire

Les ovocytes présentent également un cytoplasme riche en lipides qui augmente leur sensibilité au froid [77] et un réseau microtubulaire sous-membraneux d’actine moins important qui rend leur membrane plasmique moins robuste [78]. La plupart de ces éléments se modifient après la fécondation, rendant les embryons moins sensibles au froid et plus facilement congelables [78].

Activité métabolique

Le calcium intracellulaire est un élément fondamental du métabolisme ovocytaire, ses variations permettant l’activation ovocytaire lors de la fécondation. Or l’exposition d’ovocytes aux cryoprotecteurs comme le PROH, le DMSO et l’EG provoque une augmentation du calcium intracellulaire. Cette augmentation peut conduire à l’exocytose prématurée des granules corticaux, traduisant une activation prématurée de l’ovocyte [72].

Enveloppes ovocytaires

La membrane plasmique des ovocytes en métaphase II a un faible coefficient de perméabilité qui rend les mouvements de l’eau et des cryoprotecteurs plus lents [77]. La zone pellucide qui les entoure agit comme une barrière supplémentaire aux mouvements d’eau et de cryoprotecteurs. Il a été montré que le processus de congélation et décongélation ovocytaire peut être suivi d’une réaction corticale prématurée, secondaire à l’augmentation de calcium intracellulaire [72]. Un durcissement de la zone pellucide est alors observé [79], rendant la pénétration spermatique et la fécondation difficiles [80]. Cependant, il est possible de s’affranchir de cet inconvénient grâce à l’utilisation de l’ICSI.

Résultats

Le premier succès ayant conduit à une naissance d’un enfant vivant après vitrification ovocytaire [81] a été obtenu en utilisant une association d’éthylène glycol à très forte concentration (7,1M) et de sucrose à 0,6M. Une modification de ce protocole avec 5,5M d’éthylène glycol et 0,1M de sucrose a également été employée avec succès [82] jusqu’à l’apparition de l’association de 2,7M d’éthylène glycol, 2,1M de DMSO et 0,5M de sucrose [83] qui a été depuis la plus largement adoptée. Dans une étude comparant 251 ovocytes frais et 120 ovocytes vitrifiés [84], les taux de fécondation, de développement embryonnaire et d’implantation étaient équivalents dans les deux groupes. Ces résultats ont été par la suite confirmés dans une étude portant sur plus de 200 ovocytes dans chaque groupe [85]. La même équipe [86] dans une étude comparant plus 3000 ovocytes frais et 3000 ovocytes vitrifiés dans un programme de don d’ovocytes a confirmé l’absence d’effets délétères de la vitrification sur la fécondation, le développement et l’implantation. De nombreux travaux ont depuis confirmé ces résultats entre ovocytes frais et vitrifiés [87, 88, 89].

Ces études menées essentiellement dans des programmes de don d’ovocytes ont été en partie confirmées chez des patients infertiles pris en charge en AMP [90, 91, 92]. Si dans ces études, il n’a pas été retrouvé de différence ni dans les taux de fécondation ni dans le pourcentage d’embryons de « top-qualité » entre les ovocytes frais et vitrifiés, une tendance en faveur des ovocytes frais en termes d’accouchement était notée.

Quant à la comparaison avec la congélation lente, une étude randomisée de Smith et al. publiée en 2010 [93] montrait une augmentation significative des taux de survie, de fécondation, de développement et des taux de grossesse dans le groupe vitrifié par rapport au groupe congélation lente. La vitrification était également associée à une augmentation de tous ces paramètres dans une étude rétrospective publiée par Fadini et al. en 2009 [94].

Il existe donc maintenant un grand nombre d’études suggérant que les ovocytes vitrifiés sont fonctionnellement équivalent aux ovocytes frais en termes de fécondation, de développement et d’implantation. Il faut cependant garder à l’esprit que la très grande majorité de ces études ont été réalisées en système ouvert avec un contact direct des ovocytes avec l’azote liquide. La vitrification en système fermé ne peut atteindre les performances du système ouvert en termes de vitesse de refroidissement. Cependant, il a bien été montré que la vitesse de réchauffement est au moins aussi importante que la vitesse de refroidissement pour le succès de la vitrification, et que l’efficience de la vitrification en système fermé est hautement dépendante de cette vitesse de réchauffement [95, 96]. Par conséquent, les vitesses de réchauffement étant très peu affectées par le système fermé, la vitrification ovocytaire en système fermé apparaît non seulement possible, mais encore efficace. En effet, et bien que certains travaux aient mis en évidence la supériorité des systèmes ouverts en termes de taux survie et/ou de fécondation [92], de récentes études tendent en effet à montrer que le remplacement des systèmes ouverts par des systèmes fermés n’a pas d’impact sur les grossesses cliniques ni sur les taux d’implantation. L’équipe de Stoop et al. en 2011 [97] a étudié la vitrification d’ovocytes de donneuses en système fermé HSV, CBS®. Les résultats rapportés sur 123 ovocytes de donneuses montrent 90,2 % de survie, 77,5 % de fécondation par ovocyte injecté et 69,9 % par ovocyte dévitrifié. Dans cette étude belge, le taux de grossesse évolutive était de 45 % (9/20 transferts), mais l’âge moyen des 14 donneuses était de 26,4ans (±4,8). Le taux d’implantation global par ovocyte était de 11,7 % (13/111 ovocytes dévitrifiés).

Dans une étude prospective randomisée récente publiée par Papathedorou et al. en 2013 [98], malgré un taux de survie significativement plus faible en système fermé qu’en système ouvert (82,9 % versus 91,0 %), aucune différence statistique n’a été observée concernant les taux de grossesse, les taux d’implantation et les taux d’accouchement par rapport au système ouvert.

Nos propres résultats depuis 2012 en système fermé dans un programme de don d’ovocytes montrent un taux de survie de plus de 85 % avec en moyenne 2,2 ovocytes dévitrifiés par tentative, un taux de grossesse de 22 % par dévitrification et un taux d’implantation par ovocyte dévitrifié de 8,6 % tout à fait comparable au taux observé en don d’ovocyte synchrone qui était de 7,6 % par ovocyte mature.

En ce qui concerne le suivi des enfants, Noyes et al. [99] a recensé entre 1986 et 2008 936 naissances issues d’ovocytes congelés toutes techniques confondues dont 289 après vitrification ovocytaire. Sur les 936, 12 (1,3 %) anomalies congénitales ont été rapportées, ce qui ne diffère pas du taux d’anomalies retrouvées dans les naissances naturelles. L’étude la plus importante concernant le suivi de 200 enfants nés après vitrification ovocytaire a montré un poids moyen de naissance (2920g pour les singletons) et une incidence de malformations congénitales (2,5 %) comparables à ceux observés en conception naturelle ou après AMP [100]. Un travail de Wennerholm et al. portant sur 221 enfants nés après vitrification ovocytaire n’a pas non plus mis en évidence d’anomalies concernant l’état de santé de ces enfants [101]. Enfin, l’étude la plus récente et la plus importante publiée par Cobo et al. en 2014 [102] comparant 1027 enfants nés après vitrification ovocytaire et 1224 enfants conçus à partir d’ovocytes frais ne montre aucun effet clinique de la vitrification ovocytaire sur le devenir obstétrical et/ou périnatal des enfants.

Conclusion

La vitrification s’est maintenant imposée à travers le monde comme la méthode de congélation de référence des ovocytes et des embryons. Pour tous les stades de développement embryonnaire, il apparaît que les résultats en termes de survie et de taux de grossesse sont très supérieurs après vitrification qu’après congélation lente, excepté pour celui des embryons clivés j2–j3 où il n’y a pas d’évidence claire en faveur de l’une ou de l’autre méthode de congélation.

Si de nombreux auteurs continuent de penser que la diminution de la vitesse de refroidissement, observée avec les systèmes fermés du fait de l’isolation thermique des échantillons, réduit l’efficacité de la vitrification ovocytaire, de récentes études tendent à montrer que le remplacement des systèmes ouverts par des systèmes fermés n’aurait d’impact ni sur les grossesses cliniques ni sur les taux d’implantation. Ce problème ne se pose pas pour les blastocystes où les systèmes fermés ont montré une efficacité équivalente à la vitrification par contact direct avec l’azote liquide.

Quant au devenir des enfants, les publications les plus récentes sont très rassurantes et ne font état d’aucune augmentation du risque de malformation congénitale chez les nouveau-nés.

Si cette technique de congélation est une des avancées majeures de ces dernières années pour la prise en charge des patientes en AMP, pour la gestion du don d’ovocytes ou bien encore dans le cadre de la préservation de la fertilité, nul doute qu’elle ne manquera pas dans les années à venir de susciter de nombreux débats éthiques autour notamment de la conservation ovocytaire pour convenance personnelle à laquelle elle ouvre la voie…

Déclaration d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

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