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Apoptose et cellules trabéculaires humaines : évaluation in vitro de l'effet du bétaxolol avec ou sans conservateur - 08/03/08

Doi : JFO-10-2002-25-8-0181-5512-101019-ART2 

P. Hamard [1 et 2],

C. Debbasch [3],

C. Blondin [2],

F. Brignole [2],

K. Loison-Dayma [1],

J.-M. Warnet [3],

C. Baudouin [1 et 2]

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Résumé

Apoptose et cellules trabéculaires humaines : évaluation in vitro de l'effet du bétaxolol avec ou sans conservateur

Introduction : Chez les glaucomateux, l'augmentation de la résistance à l'écoulement de l'humeur aqueuse s'explique essentiellement par des remaniements trabéculaires pouvant être primitifs ou secondaires, une toxicité directe des collyres anti-glaucomateux sur les cellules trabéculaires n'étant pas exclue. Nous avons évalué in vitro sur des cultures de cellules trabéculaires humaines, le potentiel pro-apoptotique d'un collyre béta-bloquant, le bétaxolol, associé ou non à un conservateur, le chlorure de benzalkonium (BAC), par une méthode de cytométrie en flux et par microscopie confocale.

Matériels et méthodes : Des cellules trabéculaires humaines immortalisées provenant d'un donneur sain ont été traitées pendant 15 minutes par une suspension de bétaxolol 0,25 % conservé (bétaxolol BAC +) et non conservé (bétaxolol BAC-) diluée au 1/10 et 1/100, et par le conservateur seul (BAC 0,01 %) dilué au 1/10 (BAC 10 –3 ) et au 1/100 (BAC 10 –4 ). Vingt-quatre heures plus tard, la taille des cellules et l'expression d'un marqueur précoce d'apoptose, la molécule Apo2.7, ont été évaluées quantitativement en cytométrie en flux et qualitativement en microscopie confocale. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec une population de cellules trabéculaires non traitées (témoin).

Résultats : Le bétaxolol non conservé et le bétaxolol conservé, aux dilutions de 1/10 et 1/100 induisent une rétraction cellulaire significative par rapport au témoin, qui reste cependant inférieure à celle induite par le conservateur utilisé seul aux mêmes concentrations. Par rapport à la population témoin, dont 15,4 % des cellules expriment Apo 2.7, le bétaxolol BAC + et BAC- dilués au 1/10 induisent une augmentation significative du pourcentage de cellules Apo 2.7 positives (36,8 % et 28,1 % respectivement ; p < 0,005), mais de façon nettement moins marquée qu'après traitement des cellules par le conservateur seul dilué au 1/10 (96,9 %, p < 10 -4 ). À faible concentration (dilution au 1/100), le bétaxolol sans conservateur n'induit pas d'apoptose des cellules trabéculaires. Si le bétaxolol conservé, dilué au 1/100, induit une augmentation significative de l'expression d'Apo 2.7 par les cellules trabéculaires (24,9 %, p = 0,04), cet effet pro-apoptotique est significativement inférieur à celui induit par le conservateur seul (BAC) utilisé à une concentration équivalente (39,9 %, p < 10 -4 ).

Conclusion : À faible concentration, le bétaxolol non conservé n'a pas d'effet proapoptotique détectable sur les cellules trabéculaires tandis que le bétaxolol conservé conduit 25 % des cellules à entrer en apoptose. Cette activité proapototique du bétaxolol conservé paraît être principalement liée à la présence du conservateur, le chlorure de benzalkonium. L'importante activité pro-apoptotique du chlorure de benzalkonium utilisé seul est en majeure partie neutralisée lorsqu'il est associé au principe actif du collyre conservé, ce qui suggère un mécanisme protecteur du principe actif sur la survie des cellules trabéculaires face à une agression par le chlorure de benzalkonium.

Abstract

Human trabecular cells and apoptosis: in vitro evaluation of the effect of betaxolol with or without preservative

Purpose: Trabecular meshwork, which is involved in aqueous outflow resistance, is deeply modified in glaucoma patients, with a decrease in the trabecular cell number. Trabecular toxicity of antiglaucoma medications cannot be excluded. On a human cultured trabecular cell line, we investigated the potential proapoptotic effect of a beta-blocker with or without preservative, benzalkonium chloride (0.01% BAC), by flow cytometry and confocal microscopy.

Material and Methods: A human immortalized trabecular cell line (HTM-5) obtained from a normal donor was cultured under normal conditions. Preserved 0.25% betaxolol suspension (betaxolol BAC +), unpreserved 0.25% betaxolol suspension, and 0.01% BAC were respectively added to the culture medium in a 1/10 or 1/100 dilution for 15 minutes. After a 24-hour recovery period in normal culture conditions, cell size and the expression of an apoptotic marker, Apo 2.7, were evaluated by flow cytometry and confocal microscopy. Untreated trabecular cells were used as control cells.

Results: Preserved and unpreserved betaxolol in a 1/10 dilution induced a significant decrease in trabecular cell size compared to controls. However, this cell size decrease was less pronounced than that induced by BAC at the same dilution. Similar results were obtained with betaxolol and BAC in a 1/100 dilution. Trabecular cell Apo 2.7 expression was significantly increased after treatment with betaxolol BAC + and BAC- in a 1/10 dilution compared to controls (36.8%, 28.1%, and 15.4%, respectively p < 0.005). However, this proapoptotic activity was much less pronounced than that induced by BAC- at the same dilution (96.9%, p < 10 -4 ). Unpreserved betaxolol in a 1/100 dilution had no apoptotic activity on trabecular cells. Trabecular cell Apo 2.7 expression slightly increased with betaxolol BAC + at a 1/100 dilution (24.9%, p = 0.04), while it was greatly increased with BAC at the same dilution (39.9%; p < 10 -4 ).

Conclusion: In our model, unpreserved betaxolol at a low concentration displayed no proapoptotic activity on trabecular cells. On the other hand, preserved betaxolol displayed a moderate proapoptotic activity by triggering cell death of around 25% of cells. Trabecular cell toxicity appeared to be mainly due to the preservative benzalkonium chloride (BAC). Taken together, our results demonstrated that the strong apoptotic activity of BAC was greatly reduced within the preserved eye drops, probably through the interaction of BAC with the active compound.


Mots clés : Cellules trabéculaires , bêta-bloquant , chlorure de benzalkonium , apoptose

Keywords: Trabecular cell culture , beta-blocker , preservative , apoptosis


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Vol 25 - N° 8

P. 777-784 - octobre 2002 Retour au numéro
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