Le projet vise à obtenir un modèle organoïde 3D d’épithélium bronchique immunocompétent innervé pour une application à l’asthme sévère. L’asthme sévère touche environ 5 à 15 % des patients asthmatiques. C’est un asthme non contrôlé qui se caractérise par des exacerbations fréquentes et graves, et pour lequel les traitements sont souvent inefficaces. La construction d’un épithélium bronchique immunocompétent et innervé devrait permettre la recherche de nouveaux médicaments. En effet, il sera possible de reprogrammer des cellules circulantes de patients atteints d’asthme sévère en iPSCs et d’obtenir un modèle personnalisé, permettant de cribler et de l’étudier pharmacologiquement.

Le projet comprend en parallèle :

– la construction d’une matrice extracellulaire sous-épithéliale dans laquelle des fibroblastes bronchiques sont ensemencés ;

– la différenciation d’iPSC reprogrammées à partir de PBMC circulants en progéniteurs neuronaux et cellules de Schwann.

Les essais de matrice comprennent un mélange collagène bovin de type I (10mg/ml) et chitosan (2,8mg/ml), fabriquée selon un protocole établi à l’UPR 3572 (Muller et al., 2018) d’une part et une bioimpression de collagène et acide hyaluronique méthacrylés par nos collaborateurs de la plateforme Bioprint à Bordeaux (H Oliveira) d’autre part. La différenciation des iPSC en progéniteurs neuronaux est obtenue par inhibition de la voie des SMAD [SB431542 (40mM) et LDN193189 (0,2mM)] pendant 7jours, puis de la GSK3β (CHIR99021, 3μM). Les cellules sont cultivées dans des plaques 6 puits revêtues de Geltrex™ et le milieu de culture est changé chaque jour. Une partie des progéniteurs est différenciée en neurones sensitifs immatures par inhibition de la voie Notch (DAPT 10mM). Ces neurones immatures seront ensemencés sous la matrice où la maturation sera induite par ajout de facteurs de croissance des nerfs : NGF (10ng/mL), BDNF (20ng/mL) et GDNF (10ng/mL). L’autre partie des progéniteurs neuronaux est différenciée en cellules de Schwann jusqu’à maturation par ajout de neuroréguline 1 (192ng/ml) pendant 21jours ; elles seront ensemencées dans la matrice car leur présence favorise la croissance des neurones sensitifs (Blais et al., 2009). Le phénotype des lignées de neurones sensitifs et de cellules de Schwann est validé par immunomarquage 2D en fluorescence : anti-Tubuline ß3 (1/400^e) un marqueur neuronal, anti-substance P (1/2000^e) et anti-neurofilament M (1/2000^e) 2 marqueurs spécifiques des neurones sensitifs, anti-Sox 10 (1/100^e), marqueur des cellules de Schwann, anti-S100b (1/500^e) (cellules de Schwann matures myélinisées ou non), anti-MBP (1/2000^e) (cellules de Schwann matures myélinisées) et anti- P75NTR (1/2000^e) (précurseurs et cellules de Schwann matures non myélinisées).

Les résultats d’ensemencement des fibroblastes bronchiques humains dans les matrices montrent une colonisation des matrices collagène-chitosan, contrairement aux matrices bioimprimées. Cependant certaines matrices se sont déchirées après quelques jours de culture, dû à leur structure interne ; des mises au point sont en cours. Les neurones sensitifs sont positifs au neurofilament M, à la tubuline ß3 et à la substance P : les iPSCs ont donc bien été différenciés dans la lignée neuronale. Les cellules de Schwann sont caractérisées au 10^e jour de différenciation, ils sont positifs pour Sox 10, P75-NTR et S100b, mais ne présentent pas la MBP. Nous sommes donc en présence de cellules de Schwann matures non myélinisées. Ces cellules différenciées ont été congelées et seront ensemencées dans les matrices une fois les mises au point terminées.

Les résultats obtenus sont prometteurs. À la fin des mises au point, la matrice sélectionnée sera rendue immunocompétente par ensemencement de cellules dendritiques dérivées de monocytes isolés. Des iPSCs seront déposées sur la matrice obtenue et différenciées en épithélium bronchique selon la méthode de l’équipe de Montpellier (Ahmed, Fieldes et al., soumis) afin d’obtenir notre modèle final.