Présenter la validation d’une méthode semi-automatisée de dosage du phosphatidyléthanol 16:0/18:1 (PEth) par LC-MS/MS à partir de spots de sang séché (DBS) en plaque 96 puits. Cette méthode est comparée à la méthode de dosage manuelle, classiquement utilisée au laboratoire.

Un volume de 10 μL d’échantillon sanguin prélevé sur tube hépariné sans gel est déposé sur DBS (Ahlstrom 226, Revvity®). Le buvard est poinçonné automatiquement après identification par code barre et déposé dans une plaque de filtration Sirocco de 96 puits de manière semi-automatisée à l’aide d’un système Panthera-Puncher 9 (Revvity®) muni d’un poinçon de 6 mm. Un volume de 200 μL de méthanol contenant l’étalon interne deutéré (PEth-D5) est ajouté. Après agitation 30 minutes et centrifugation, la plaque de collecte 96 puits est thermoscellée. L’analyse est réalisée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS), avec une séparation en 9 minutes sur une colonne en phase inverse Kinetex C18 (Phenomenex®) maintenue à 40 °C. L’identité des patients est automatiquement transférée du puncher vers le système analytique. La détection est assurée par une source électrospray en mode négatif et par multiple reaction monitoring (MRM). Les transitions m/z sélectionnées sont 701,5 > 255,2 (ion quantificateur) et 281,2 (ion qualificateur) pour le PEth, et 706,5 > 255,2 pour le PEth-D5. La validation de méthode respecte les exigences de la norme d’accréditation COFRAC NF ISO 15189 (portée B).

Le PEth et son étalon interne sont détectés au temps de rétention 3,3 min sans aucune interférence significative avec la matrice ou d’autres analytes. Les droites d’étalonnages sont linéaires (r ² > 0,998) dans une gamme de concentrations allant de 10 à 1000 μg/L. La limite inférieure de quantification (LLOQ) est évaluée à 5 μg/L et la limite supérieure de quantification (ULOQ) est évaluée à 2500 μg/L. L’analyse des contrôles qualités maisons (20 et 200 μg/L) ou commerciaux (ACQ Science®) (30 et 400 μg/L) montre une exactitude et une précision intra- et inter-essais satisfaisantes (≤ 20 % et 15 %, respectivement). Les résultats obtenus indiquent que la méthode semi-automatisée donnent des résultats satisfaisants équivalents à ceux obtenus avec une méthode manuelle. Cette méthode permet une préparation rapide des échantillons, un temps d’analyse de 9 minutes et une absence de contamination inter-échantillons. Les mesures de LLOQ et de ULOQ permettent de rendre des résultats en accord avec les seuils décisionnels de 20 et 200 μg/L usuellement recommandés.

La méthode de préparation d’échantillons et de dosage développée pour l’analyse du PEth permet de satisfaire à une utilisation dans un contexte clinique ou médico-légal de manière rapide, reproductible et avec une identitovigilance améliorée par rapport à une méthode d’extraction manuelle classique. L’extraction semi-automatisée de DBS en plaque 96 puits représente une alternative d’avenir pour prendre en charge un nombre important d’échantillons micro-volumétriques en LC-MS/MS.