La détermination des androgènes est particulièrement problématique chez les femmes étant donné les basses concentrations de testostérone totale (T tot) et de testostérone biodisponible (T Bio) respectivement 10 et 100 fois plus faibles que chez les hommes. De plus, les femmes sous estrogènes par voie orale ont des taux de T tot augmentés en raison de l'accroissement de la sex hormone binding globuline (SHBG) alors qu'en fait, la fraction libre ou biodisponible de la testostérone est diminuée. Ce qui en fait le paramètre de choix à mesurer puisque seule la testostérone non liée à la SHBG (T libre+T liée à l'albumine) diffuse facilement de la circulation pour être captée au niveau tissulaire et agir sur les cellules cibles. La technique directe RIA avec traceur analogue n'est pas recommandable, les déterminations dans la salive donnent des résultats très variables et la mesure de la Free T dans le dialysat n'est pas commercialisée et reste longue et délicate. L'objectif du travail est d'évaluer une technique sensible pour doser la T tot et la T Bio en faibles concentrations dans le syndrome d'insuffisance en androgènes (autre que la ménopause) avec des taux d'androgènes à (ou sous) la limite inférieure du quartile le plus bas des femmes en âge de reproduction (20-40 ans) en présence de signes cliniques et d'un statut adéquat en estrogènes. La technique la plus spécifique en analyse des stéroïdes, à savoir la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse avec dilution isotopique (ID-GCMS) n'a pas été utilisée pour valider les méthodes de détermination de la T Bio. Pour ce faire, nous comparons deux techniques de détermination expérimentale (indirecte et directe) de la testostérone biodisponible (T Bio): 1) la méthode indirecte en mesurant le pourcentage de stéroïde non lié à la SHBG après équilibrage à 37 °C du sérum mis en présence d'une dose de testostérone marquée au tritium [³H]T récemment purifiée et précipitation par une solution saturée de sulfate d'ammonium (finale: 50% saturation); pour obtenir la concentration de T Bio: T Bio ³H E170 (III) ou T Bio ³H MS (IV), on a multiplié ce pourcentage par la T tot: T tot E170 (I) ou T tot MS (II) déterminée respectivement par la méthode ECLIA sur Modular E-170 Roche et par ID-GCMS; 2) la mesure directe par ID-GCMS de la concentration en T Bio MS (V) dans le surnageant après la précipitation au sulfate d'ammonium de ce qui est lié à la SHBG. La sensibilité de la technique ID-GCMS pour un rapport signal/bruit de 3:1 est de 2 pg injectés de testostérone dérivée. Pour les méthodes ID-GCMS II et V respectivement, les taux moyens de récupération sont de 82 et 92%, les coefficients de variation (CV) intraessais sont de 3,9% (126 pg/ml) et 6,2% (13,8 pg/ml), les CV interessais sont de 4,3% (126 pg/ml) et 17,3% (15,4 pg/ml). Pour les méthodes T Bio ³H III et IV, les CV intra- et interessais sont de 4,5% (2,8 pg/ml) et 3,7% (58,4 pg/ml). Les résultats des dosages réalisés en simple par les différentes techniques démontrent des corrélations hautement significatives (p<0,001) pour la T tot I versus II (r=0,88) et entre techniques indirectes (III ou IV) et directe (V) pour la T Bio: III versus V (r=0,85) et IV versus V (r=0,90). Ceci démontre la validité analytique de la méthode d'approche indirecte si on considère la technique directe par ID-GCMS comme procédure de référence. La méthode T tot E170 (I) a des performances acceptables (CV interessais=20% à 120 pg/ml) pour la routine mais la méthode T tot MS (II) est indispensable pour les valeurs basses (CV interessais=4,3% à 126 pg/ml) ou si un maximum de fiabilité est requis. La validité des résultats de T Bio ³H dépend de la validité des résultats de T tot sur la base desquels ils sont calculés. En dépit de cette limitation et si on souhaite ne pas dépasser une imprécision (CV) intra- de 5% et interessais de 10% à (ou sous) la limite inférieure du quartile le plus bas (T Bio<6 pg/ml) des taux d'androgènes des femmes en âge de reproduction (20-40 ans), seules les méthodes T Bio ³H (III et IV) sont à retenir en dépit de la sensibilité élevée mais insuffisante de la méthode directe (V) par ID-GCMS.

Accurate measurement of androgens is particularly problematic in women who have lower plasma concentrations of total T (T tot) and Bioavailable Testosterone (T Bio) respectively 10-fold and 100-fold lower than men. Moreover, women taking oral estrogens have higher levels of T tot because of the increase in sex hormone binding globulin (SHBG) levels. It results that Bioavailable or Free T is decreased and this is the best parameter to measure because the only non-SHBG bound Testosterone (Free T + albumin-bound T) diffuses easily from circulation to tissues and is available for target cells. Direct RIA using the analog tracer technique has little to recommend it, salivary assays are highly variable and those that directly measure Free T in the dialysate are not commercially available and are labor intensive. The objective of this study is to evaluate a sensitive method for the measurement of the low total and bioavailable Testosterone levels in Female Androgen Insufficiency (FAI) other than menopause with androgen values at or below the lowest quartile of the reference range for reproductive age women (20-40 years) in conjunction with the presence of clinical symptoms and adequate estrogen status. An application of the most specific technique of steroid analysis, the Stable Isotope Dilution/Gas Chromatography-Mass Spectrometry (ID-GCMS) to validate Bioavailable Testosterone assays has been lacking to date. Therefore, we compare two experimental approaches (indirect and direct) to determine T Bio: 1) the indirect determination by measurement of the percentage of non-SHBG bound steroid after incubating at 37 °C the serum samples with freshly purified tracer dose of tritiated testosterone [³H]T and precipitation with saturated ammonium sulfate solution (final: 50% saturation); to obtain the concentration of T Bio: T Bio ³H E170 (III) or T Bio ³H MS (IV), we multiplied this percentage by total Testosterone: T tot E170 (I) or T tot MS (II) determined respectively by the ECLIA method on Modular E-170 Roche and by ID-GCMS; 2) the direct measurement by ID-GCMS of the T Bio MS (V) concentration in the supernatant after the ammonium sulfate precipitation step. Sensitivity of ID-GCMS (with a signal to noise of 3:1) is 2 pg injected of derivatized Testosterone. For the ID-GCMS methods II and V, the overall method recoveries are 82% and 92% respectively, CV within-assay are 3.9% (126 pg/ml) and 6.2% (13.8 pg/ml), CV between-assays are 4.3% (126 pg/ml) and 17.3% (15.4 pg/ml). For the T Bio ³H methods III and IV, within- and between-run CV are 4.5% at 2.8 pg/ml and 3.7% at 58.4 pg/ml respectively. Our data show highly significant (P<0.001) correlation coefficients for Ttot: I with II (r=0.88) and between indirect (III or IV) and direct techniques (V) for T Bio: III with V (r=0.85) and IV with V (r=0.90). This demonstrates the analytical validity of the indirect approach if we consider the direct technique by ID-GCMS as a reference measurement procedure. The method T tot E170 (I) has acceptable performance (between-run CV=20% at 120 pg/ml) for routine investigations but T tot MS (II) is required at lower levels (between-run CV=4.3% at 126 pg/ml) or whenever maximal reliability is requested. The validity of the T Bio ³H results depends on the validity of the total T results on which they are calculated. Despite this limitation, if we use the criteria of maintaining imprecision within- and between-run (CV)<5% et<10% respectively at or below (T Bio<6 pg/ml) the lowest quartile of the reference range for reproductive age women (20-40 years), T Bio ³H methods III and IV are the only adequate techniques for routine use although the direct ID-GCMS method V has high but insufficient sensitivity.