Les traitements actuels des adénocarcinomes pulmonaires (LUAD) présentent des taux de réponse médiocres et incompatibles avec une prise en charge thérapeutique efficace. Il devient donc urgent de proposer de nouvelles stratégies pour empêcher la résistance aux traitements. La réponse aux anticancéreux anti-LUAD est variable et multifactorielle : elle comprend des voies intrinsèques altérées ou des facteurs extrinsèques tels que l’hypoxie. Les récentes avancées technologiques en génomique du cancer ont permis de mettre en évidence l’expression aberrante d’ARN non codants comme un déterminant majeur de la résistance précoce aux traitements. Notre objectif est d’acquérir de nouvelles connaissances sur les fonctions des longs ARN non codants (lncRNAs) dont l’expression est liée à un mauvais pronostic pour les patients atteints de LUAD, en conditions normoxie et hypoxie.

Nous avons développé un crible transcriptomique à l’échelle de la cellule unique basé sur l’interférence CRISPR (CRISPRi) sur nos meilleurs candidats lncRNA (approche CROP-Seq [1Datlinger P., Rendeiro A.F., Schmidl C., e al. Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout Nat Methods 2017 ;  14 : 297-301 [cross-ref]

Cliccare qui per andare alla sezione Riferimenti]). Une mini-bibliothèque CROP-seq comprenant des RNA guides préalablement validés et permettant la diminution de l’expression de huit candidats lncRNA et de plusieurs régulateurs clef de la réponse hypoxique (HIF1A, HIF2A) a été amplifiée et ensuite utilisée pour transduire des cellules A549 LUAD exprimant la protéine de fusion dCas9-KRAB-MeCP2 cultivées en normoxie ou en hypoxie à trois temps différents (3, 6 et 24 heures). Les cellules des quatre conditions ont été ensuite regroupées, marquées par des anticorps à code-barres et analysées par RNA-Seq à l’échelle de la cellule unique, reliant l’expression de l’ARN guide aux réponses du transcriptome dans les cellules individuelles dont l’expression de chacun des lncRNA est diminuée.

Nous décrivons ici la méthodologie de cette approche et la validation de cette stratégie sur les régulateurs clef de la réponse hypoxique. De plus, nos données indiquent que plusieurs lncRNAs peuvent être impliqués dans la régulation de la survie cellulaire, de l’adhésion cellulaire et/ou de la réponse hypoxique.

En Conclusion, cette méthode devrait améliorer les connaissances sur les fonctions associées aux lncRNA et fournir de nouvelles cibles potentielles associées à la résistance aux médicaments dans le cancer du poumon.