Objectif La validation analytique du screening toxicologique n’est pas clairement définie dans la norme NF EN ISO 15189. Seul le groupe de travail « Scientific Working Group for Forensic Toxicology » (SWGTOX) a proposé une méthodologie adaptée aux méthodes qualitatives de type screening [1Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology J Anal Toxicol 2013 ;  37 : 452-474

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Cette méthodologie a été appliquée dans le but de valider notre méthode de screening.

Après déprotéinisation, les échantillons sanguins sont analysés par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse haute résolution (LC-HRMS, QExactive Focus, Thermofisher Scientific). La séparation est réalisée sur une colonne Accucore Phenyl-Hexyl (100×2,1mm, 2,6μm). L’acquisition des données se fait pendant 15minutes en mode Full-MS avec confirmation en dd-MS². L’exploitation des données est réalisée via le logiciel TraceFinder^®. Cent soixante-quatorze molécules les plus fréquemment identifiées au laboratoire ont été choisies et réparties en 4 pools pour la validation. Les paramètres évalués ont été : les limites de détection (LOD) et d’identification (LOI), le rendement d’extraction (RE), l’effet matrice (ME), la sélectivité et la contamination. La LOI correspond à la plus faible valeur de concentration permettant une confirmation de la présence d’une molécule basée sur : le rapport m/z de l’ion pseudo-moléculaire avec une précision de 5ppm, le temps de rétention (±30s), la présence de deux fragments majoritaires, un score de profil isotopique>70 et un score de comparaison des spectres>80. La LOD est évaluée avec les mêmes critères sauf celui du score de comparaison des spectres. Les LOI et LOD ont été validées en intra-jour (n=6) et inter-jour (n=4) à partir de surcharges à différents niveaux de concentration de sang vierge. Les ME et RE ont été étudiés selon l’approche quantitative (n=10) à deux niveaux de concentrations.

Les LOD et LOI ont pu être déterminées pour 97 % des molécules et sont comprises entre 0,125 et 1000ng/mL avec des valeurs inférieures aux valeurs usuelles. Le RE moyen est de 114±45 %. Aucun effet matrice n’a été observé pour 69 % des molécules, d’après les critères du groupe SWGTOX (ME<25 % avec un Coefficient de variation CV<15 %). Pour les autres molécules, l’effet le plus fréquemment mesuré est un effet d’enrichissement d’ions avec des CV inférieurs à 30 %. L’absence de tout signal interférant provenant de composés endogènes dans le sang vierge (n=10) indique la bonne sélectivité de la méthode. Après la mise en place d’un rinçage de l’aiguille avant et après injection d’un échantillon, les essais n’ont pas mis en évidence de contamination.

Sur les 174 molécules testées, les critères de validation sont conformes pour 120 molécules et les 54 autres molécules n’ont pas pu être validées à cause d’un ME supérieur aux recommandations. Une simple précipitation ne semble pas suffisante pour éliminer l’ensemble de ces ME. Ainsi, les recommandations américaines concernant l’effet matrice semblent difficiles à atteindre lorsqu’il s’applique à un très large panel de molécules. D’après notre expérience, ceci est d’autant plus marqué avec l’analyse de sang post-mortem en partie décomposé et putréfié. Une méthode d’extraction plus complexe et optimisée pourrait potentiellement permettre d’atteindre les critères de ME du groupe SWGTOX.