La mise en évidence d’une consommation de benzodiazépines (BZD) fait partie du panel usuel des analyses à réaliser en urgence dans un contexte de toxicologie clinique. Le laboratoire se repose le plus souvent sur des méthodes d’immunochromatographie ou d’immunochimie qui permettent d’obtenir rapidement un résultat, mais souffrent de deux défauts majeurs : une réponse qualitative et de nombreux faux négatifs. Dans ces travaux, nous avions pour objectif de développer une méthode permettant un dosage ultra-rapide de BZD par couplage d’une sonde de type Probe ElectroSpray Ionization (PESI) à la spectrométrie de masse avec une approche par dilution isotopique.

Le système d’analyse était composé d’une source PESI, couplée à un spectromètre de masse de type triple quadripôle (LC-MS 8060, Shimadzu®). Un mode Multiple Reaction Monitoring (MRM) en ionisation positive a été employé. Une quantification par dilution isotopique a été appliquée en employant un étalon interne (EI) deutéré pour chacune des molécules suivantes : alprazolam, bromazépam, diazépam, nordiazépam, oxazépam, témazépam, zolpidem et zopiclone. La méthode incluait également des designers BZD : clonazolam, deschloroétizolam, diclazépam, étizolam, flualprazolam, flubromazépam, flubromazolam, méclonazépam, nifoxipam et pyrazolam. Les performances de la méthode ont été comparées à une méthode LC-MS et une méthode immunochimique (Serum Benzodiazepines, Architect Abbott®) en analysant les sérums de 40 patients.

La préparation consistait en une simple dilution de 10μL d’échantillon dans 500μL d’un mélange éthanol/formiate d’ammonium 10mM contenant les EI deutérés à une concentration de 50μg/L. Le temps d’analyse pour les 18 BZD était de 2,5min. Les limites de quantification étaient comprises entre 5 et 50μg/L. L’approche par dilution isotopique a permis d’obtenir des coefficients de variabilité intra- et inter-jour inférieurs à 20 % et des biais relatifs inférieurs à 15 % pour l’ensemble des molécules quantifiées. Les effets matrices étaient compensés par les EI deutérés et la spécificité a été vérifiée par l’analyse d’échantillons surchargés par un mélange de 119 molécules psychotropes (n=6). Dans le groupe de 40 patients, 100 % des BZD détectées par LC-MS (n=89) l’ont également été par PESI-MS et une analyse de régression a rapporté d’excellents résultats (r²=0,93). La méthode d’immunochimie n’a rendu que 37 patients positifs sur 40 : 2 cas de présence de bromazépam et 1 cas de présence de zolpidem rendus négatifs à tort.

Nous proposons une méthode permettant la détection et la quantification d’un large panel de BZD (commerciales et illicites) en moins de 3minutes. Une telle rapidité est obtenue grâce à une source PESI avec laquelle la préparation d’échantillon se résume à une simple dilution et une quantification par dilution isotopique qui évite le recours à des droites de calibration. Cette méthode PESI-MS permet également d’améliorer la spécificité par rapport à une approche classique d’immunochimie en assurant la détection de molécules apparentées aux BZD et de designer BZD.